BMC Plant Biology|比较分析白头翁属物种的叶绿体基因组揭示了新发现的濒危物种岩生白头翁的进化和分类地位

摘要

本研究结果显示，P. saxatilis的叶绿体（cp.）基因组总长度为162,659 bp，GC含量为37.5%。该cp.基因组包含134个基因，包括90个已知的蛋白编码基因、36个tRNA基因和8个rRNA基因。P. saxatilis表现出与其他白头翁属物种相似的特征。在此，我们比较了包括P. saxatilis在内的10个物种的cp.基因组，发现白头翁属的cp.基因组极为相似，长度在162,322–163,851 bp之间。此外，白头翁属cp.基因组的SSR长度范围为10到22 bp。在cp.基因组的四个结构区域中，大多数长重复和SSR检测到在LSC区域，其次是SSC区域，而在IRA/IRB区域最少。最常见的长重复类型是正向重复和回文重复，其次是反向重复，只有少量互补重复在10个cp.基因组中被发现。我们还分析了核苷酸多样性，识别了ccsA_ndhD、rps16_trnK-UUU、ccsA和rbcL，这些基因可以作为识别白头翁属物种的潜在分子标记。通过连接高变异区域序列构建的系统发育树的结果与cp.基因的系统发育树一致，P. saxatilis更近的亲缘关系物种被确定为钟萼白头翁（P. campanella）。

本研究确定了P. saxatilis最接近的物种是P. campanella，这与基于花粉粒特征得出的结论一致，但与基于形态特征确定的P. chinensis不同。通过揭示叶绿体特征、cp.基因组的发展和进化以及潜在的分子标记，本研究为白头翁属的进化、遗传多样性和物种鉴定提供了有效的分子数据。   

比较分析白头翁属物种的叶绿体基因组揭示了新发现的濒危物种岩生白头翁的进化和分类地位

Comparative analysis of chloroplast genomes of Pulsatilla species reveals evolutionary and taxonomic status of newly discovered endangered species Pulsatilla saxatilis

时间：2024 杂志：BMC Plant Biology 影响因子：4.3 分区：1/2区

研究方法

1、植物材料和DNA提取

从中国辽宁省凤城市的白云山（E 81°89′30″，N 43°26′98″）采集了岩生白头翁（P. saxatilis）的新鲜幼叶，随后使用硅胶进行干燥。使用植物组织叶绿体DNA提取试剂盒（Genmed Scientific Inc., Arlington, MA）提取总基因组DNA。

2、cpDNA的测序、组装和基因注释

使用NexteraXT DNA文库制备试剂盒（Illumina, San Diego, CA）构建了插入片段长度为350 bp的测序文库。随后，在Illumina Novaseq 6000测序平台上对该文库进行了双端测序。使用NGS QC Tool Kit v2.3.3 对原始数据进行了编辑。此外，使用de novo软件SPAdes v3.11.0 将高质量的reads组装成cp.基因组。随后，使用PGA程序对基因组进行了注释，以兴安白头翁（Pulsatilla dahurica，NCBI登录号：MK860685.1）的cp.基因组作为参考。最后，将编辑后的GenBank注释文件提交到OGDRAW绘制注释图 。

3、cp.基因组的比较基因组分析

为了研究白头翁属的cp.基因组序列差异，使用mVISTA（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml）可视化10个白头翁属物种的cp.基因组序列，以P. chinensis作为参考；此外，使用Shufe-LAGAN模式的默认参数进行cp.基因组比较。为了明确序列变异水平，使用MEGA 6.0软件 计算白头翁属cp.基因组中的SNP变异和K2p距离。

为了探索白头翁属物种中的热点区域并促进其在鉴定中的应用，提取了cp.基因组的编码序列（CDS）、内含子和IGS，并使用MAFFT v7进行序列比较；此外，使用DNAsp v6软件分析了核苷酸和单倍型多样性。将多个具有较高Pi值的序列构建系统发育树。使用MAFFT v7进行cp.基因组比较，使用IQ-TREE（v1.6.12）进行最优核苷酸模型筛选和最大似然树分析。   

3、密码子偏好分析

通过CodonW v1.3软件进行密码子使用偏差分析和RSCU值计算。RSCU值大于1表示频繁使用的密码子偏好，RSCU值小于1表示较少使用的密码子偏好，而RSCU值为1表示没有密码子使用偏好。

4、进化选择压力分析

首先，使用MAFFT v7.429比较10个白头翁属物种的同源基因序列（选择默认参数）。并获得一个对齐良好的fasta格式序列文件。然后使用IQTREE 1.6.12生成树文件。最后，使用PAML V4.9的codeml程序计算Ka、Ks和Ka/Ks值，并整理和可视化结果。

5、重复序列和SSR分析

使用MISA软件（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）识别SSR，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸序列的最小重复次数分别设置为10、5、4、3、3和3 。

使用在线软件REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer/）识别分散重复（正向、反向、回文和互补），最小重复大小设置为30 bp，汉明距离设置为3 。

通过运行基于Web的串联重复查找器（https://tandem.bu.edu/trf/trf.html）识别串联重复，其中两个重复拷贝的相似性百分比至少为90%，最小重复大小为10 bp。对齐参数设置为匹配、错配和插入缺失分别为2、7和7。

6、系统发育分析   

使用MAFFT v7 进行cp.基因组比对对齐，并使用Gblocks去除对齐间隙。共对齐了25个cp.基因组。使用最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）方法推断系统发育树。使用IQ-TREE（v1.6.12）进行ML树分析。系统发育分析使用在贝叶斯信息准则（BIC）下通过ModelFinder 选择的最佳拟合核苷酸替代模型，所用的最优核酸替代模型为TVM + F + R2。此外，使用MrBayes v3.2.6 进行BI。Markov链蒙特卡洛（MCMC）分析运行两次，共500万代。每1000代进行一次统计。“丢弃”与“烧入”期对应的前25%的树，剩余的三部分用于构建多数规则共识树。根据BIC，所用的最优核酸替代模型为GTR + F + I + G4。

7、分歧时间分析

使用MAFFT v7进行cp.基因组对齐，然后使用Gblocks去除模糊区域（去除包含比较间隙的位置）。修改后的序列用于构建系统发育树。我们选择了四个节点来确定分歧时间：（1）人参（Panax ginseng）和委陵菜（Potentilla Chinensis）分歧118百万年前（范围：111.4–123.9百万年前）；（2）人参（Panax ginseng）和钟萼白头翁（P. campanella）分歧129百万年前（范围：126.0–132.4百万年前）；（3）钟萼白头翁（P. campanella）和罂粟莲花（Anemoclema glaucifolium）分歧26.0百万年前（范围：9.4–40.8百万年前）；（4）钟萼白头翁（P. campanella）和凡可獐耳细辛（Hepatica falconeri）分歧28.2百万年前（范围：9.7–34.4百万年前）。

参考上述节点，我们使用BEAST v2.6.2对25个物种的cp.基因组序列进行分歧时间推断。使用严格时钟作为推断方法；在MCMC操作中进行1000万代测试。在合并树的过程中，每1000代进行一次统计。最后，丢弃前25%的树作为老化树；其余树合并以推断由树结构和节点表示的分歧时间。使用Tracer 1.7.1查看ESS参数大于200的树文件。最后，使用FigTree v1.4.4查看并美化树的结果 。

主要研究结果

1、P. saxatilis的cp.基因组基本特征

在本研究中，我们首次测序并报告了P. saxatilis的完整cp.基因组。整个基因组的长度为162,659 bp，具有典型的环状结构，GC含量为37.5%。此外，P. saxatilis的完整cp.基因组（如图2所示）由两个反向重复区（IRA和IRB）、一个大单拷贝区（LSC，82,225 bp）和一个小单拷贝区（SSC，17,848 bp）组成。该基因组包含134个基因，包括90个已知的蛋白编码基因（PCGs）、36个tRNA基因和8个rRNA基因。编码基因的总长度为94,918 bp，占基因组总长度的58.35%。P. saxatilis cp.基因组中注释的基因列在表1中。此外，rps12基因是反式剪切的基因。

图1 P. saxatilis的cp.基因组结构注释图。位于外圈外侧的基因按顺时针方向转录，而位于外圈内侧的基因则按逆时针方向转录。不同功能的基因采用不同颜色编码。内圈中的灰色直方图显示了基因组的GC含量，中间的灰色线表示50%的阈值线。

表1 P. saxatilis的cp.基因组基因注释表   

2、白头翁属的cp.基因组比较分析

10种白头翁属物种的完整cp.基因组长度范围为162,322 bp（P. campanella）到163,851 bp（P. chinensis），最大差异为1,529 bp，最小差异为31 bp。LSC区域的大小范围为81,894 bp（P. dahurica）到82,606 bp（P. tongkangensis），最大差异为712 bp，最小差异为29 bp。此外，SSC区域的大小范围为17,497 bp（P. campanella）到19,272 bp（P. chinensis），最大差异为1,775 bp，最小差异为5 bp。IR区域的大小变化范围为31,084 bp（P. tongkangensis）到31,410 bp（P. cernua），最大差异为326 bp，最小差异为1 bp。此外，GC含量范围为37.1%到37.5%。我们还发现所有物种的基因数量保持一致。总共观察到134个基因，包括36个tRNA、8个rRNA和90个PCGs，其中14个tRNA和8个rRNA位于IR区域。在比较七种物种和三个亚种单位的白头翁属的cp.基因特征时，我们发现cp.基因高度保守（表2），并且10种物种中不同基因的相对位置和大小相似。

表2 10种白头翁属物种的cp.基因组特征总结   

10种白头翁属物种的cp.基因组整体序列同一性使用mVISTA绘制，以P. chinensis的注释作为参考。这10个物种表现出高度的序列相似性，IR区域比单拷贝区域更为保守。编码区域中的遗传变异比非编码区域（IGS）少。编码区域有三个高差异区域，即ycf1（位于SSC-IRA区域的ycf1）、ycf2和ndhF。此外，在IGS中观察到显著差异，高度可变的IGS区域包括rps16_trnK-UUU、trnY-GUA_trnD-GUC、ndhC_trnV-UAC、ndhF_trnL-UAG和ccsA_ndhD。

为了进一步了解10种白头翁属物种cp.基因组序列之间的差异，我们使用核苷酸替换数和Kimura 2参数（K2p）距离来表示差异程度。10个物种的核苷酸替换数范围为17到1308，K2p距离范围为0.0001到0.00816（表3）。P. chinensis var. kissii和P. chinensis具有最小的序列差异，而P. dahurica和P. campanella具有最大的序列差异。

图3 10种白头翁属物种的cp.基因组序列比较基因组可视化，以P. chinensis作为参考序列。y轴显示同一性百分比范围为50-100%，而x轴显示cp.基因组内的位置。每个箭头表示参考基因组中注释基因及其转录方向。基因组区域，即编码序列、非编码序列和RNA，采用不同的颜色编码。

表3 10个完整cp.基因组中的核苷酸替换数和序列距离   

3、核苷酸多样性（π）

计算了10种白头翁属物种cp.基因组中78个基因、基因内含子和IGS区域的核苷酸和单倍型多样性以及GC含量（图4，表S1）。在78个基因中，rpl36基因的π值最高，达到0.01754。具有高π值的基因主要分布在LSC区域，而SSC区域和IRA或IRB区域的基因π值中等或较低，表明IR区域极为保守，对这些基因的进化压力不太敏感。在基因内含子区域，rps12内含子的π值高达0.09763，其他内含子的π值与基因区域相似。此外，我们在IGS区域观察到高度的核苷酸多样性，ccsA_ndhD的最大π值为0.06066，IGS区域的π值明显高于基因区域。具有高π值的内含子、IGS区域和编码区域基因以及三个通用的cp.DNA条码psbA_trnH、matK和rbcL列于表4。   

图4 白头翁属的cp.基因组的核苷酸和单倍型多样性

表4 白头翁属中7个可变标记基因和通用cp.DNA条码（rbcL、matK和psbA_trnH）的可变性

4、密码子使用偏好性

密码子偏好性是指在蛋白质翻译中密码子的使用频率，它受到多种因素的影响，例如基因突变和核苷酸组成。密码子使用偏好性通常通过相对同义密码子使用（RSCU）、密码子使用数量以及每种氨基酸的密码子比例来评估。

P. saxatilis的cpDNA包含27,709个密码子，编码总共20种氨基酸。从密码子分类分析中，我们发现最常编码的氨基酸是亮氨酸（Leu），共有2831个密码子（占10.22%），包括6个同义密码子，其中UUA密码子最为常见（表5，图S1）。其次是异亮氨酸（Ile，占8.69%）、丝氨酸（Ser，占7.59%）、甘氨酸（Gly，占6.76%）、精氨酸（Arg，占6.13%）和苯丙氨酸（Phe，占5.50%）。半胱氨酸（Cys，328个）是编码最少的氨基酸。在这些密码子中，AUU（1162个密码子）编码异亮氨酸（Ile），而UGC（95个密码子）编码半胱氨酸，是使用频率最高和最低的密码子（表5）。   

10种物种的cp.基因组中的密码子使用高度相似。所有识别的30个密码子的RSCU值均大于1，表明对这些密码子的使用存在偏好（表5）。在第三个位置，16个密码子以U（T）结尾，13个以A结尾，只有一个以G结尾，这表明白头翁属的 cpDNA在第三个位置上对A/T的强烈偏好。此外，起始密码子AUG和编码色氨酸的密码子UGG的RSCU值均为1，表明没有偏好，而终止密码子UAA的RSCU值大于1，表明存在偏好。

表5 P, saxatilis中蛋白编码基因的相对同义密码子使用（RSCU）

5、进化选择压力分析

非同义替换率（Ka）、同义替换率（Ks）和Ka/Ks比率通常用于评估基因序列之间的进化速率，并更好地阐明选择压力是否与特定的蛋白编码基因相关。计算了10种白头翁属属物种cp.基因组中78个蛋白编码基因的Ka/Ks值。结果显示，大多数基因的Ka值小于Ks值，即Ka/Ks < 1，这意味着大多数蛋白编码基因在进化过程中经历了净化选择。仅有ycf2基因显示出Ka/Ks > 1，表明该基因受到正向选择的影响（图5，表S2）。   

图5 35个蛋白编码基因的Ks值

6、长重复序列和SSR分析

我们的研究发现，最常见的长重复类型是正向重复和回文重复，其次是反向重复，而在10个cp.基因组中仅发现少量互补重复。大多数重复序列较短，长度范围为30-49 bp。大多数单核苷酸重复由A/T组成，其他SSR类型主要包括AT/TA，G/C的数量很少。每个10个cp.基因组包含83-93个SSR，这些SSR的长度范围为10-22 bp。在cp.基因组的四个结构区域中，大多数长重复和SSR检测到在LSC区域，其次是SSC区域，而在IRA/IRB区域最少。上述结果如图6所示。

7、系统发育分析

使用完整的cp.基因组为10种白头翁属物种和13种其他毛茛科物种构建了系统发育树（图7）。选择了最佳的氨基酸替换模型GTR + F + I + G4，以蔷薇科的委陵菜（Potentilla Chinensis）和五加科的人参（Panax ginseng）作为外群聚类。生成的系统发育树包含22个节点，其中大多数节点显示出完美的自助法和贝叶斯检验后概率支持。最大似然（ML）系统发育树的结果如图7所示。贝叶斯推断（BI）树的拓扑结构与ML树一致。P. saxatilis与P. campanella形成姐妹关系（红色），而形态上最相似的P. chinensis则位于更远的系统发育位置。结合形态特征，系统发育结果进一步验证了P. saxatilis是一个独立的新物种。   

图7 基于完整cp.基因组序列，使用最大似然（ML）和贝叶斯推断方法构建的Pulsatilla saxatilis及其他24个物种的系统发育树。分支的数字表示ML支持值/贝叶斯后验概率。

表4中的十个序列分别从cp.基因中提取，使用MAFFT v7进行比对，并选择最佳氨基酸替换模型构建系统发育树。rps16_trnK-UUU（A）和rbcL（B）的系统发育树如图8所示，基于其他八个序列构建的系统发育树见图S3。同时，根据核苷酸和单倍型多样性分析结果，以下六个序列表现出最高的π值：rps12内含子、ccsA_ndhD、psbL_psbF、rps16_trnK-UUU、trnE-UUC_trnY-GUA和trnY-GUA_trnD-GUC。我们使用MAFFT v7分别对这六个序列进行比对，然后将序列连接在一起。使用Gblocks对模糊区域进行修剪，得到的序列用于构建系统发育树。贝叶斯推断（BI）树的最佳氨基酸替换模型为GTR + F + G4。我们的研究发现，BI树与基于cp.基因组的系统发育树具有相同的拓扑结构，且所有分支均具有高支持值（图9B）。最大似然（ML）树的最佳氨基酸替换模型为F81 + F。此外，ML树（图9A）与前两棵树有所不同，P. cernua、P. tongkangensis、P. cernua f. plumbea和P. dahurica形成的分支关系不同，且自助法支持值略低。   

图8 基于rps16_trnK-UUU（A）和rbcL（B）使用最大似然（ML）方法构建的10种白头翁属物种及外群大火草（Anemone tomentosa）的系统发育树。分支的数字表示ML支持值。

图9 基于高变异区域序列使用最大似然（ML）方法（A）和贝叶斯推断方法（B）构建的10种白头翁属物种及外群大火草（Anemone tomentosa）的系统发育树。分支的数字表示ML支持值/贝叶斯后验概率。红色分支代表P. saxatilis及其姐妹分类群，蓝色标记表示两棵树之间的不同分支。

8、时间估计

在进行最大似然（ML）系统发育重建后，建立了一个分歧时间，以人参（Panax ginseng，KM067390）作为根种，估计为1.24亿年前。白头翁属的单系群大约在2176.19万年前发生分歧，白头翁属（Pulsatilla）与银莲花属（Anemone）大约在1212.8万年前分歧。白头翁属属内物种的分支大约在429.22万年前发生隔离。岩生白头翁（Pulsatilla saxatilis）与钟萼白头翁（Pulsatilla campanella）之间的分化发生在约229.63万年前（图10）。   

图10 基于完整cp.基因组序列通过BEAST分析获得的10种白头翁属物种的分歧时间。节点旁边显示了节点的平均分歧时间，而蓝色条形表示95%的最高后验密度（HPD）。

讨论

1、白头翁属的cp基因组比较分析

从白头翁属的cp基因组序列比较基因组可视化（图3）中，可以直观地看到不同白头翁属物种的cp基因组具有相似的结构和基因序列。此外，非编码区的分歧水平高于编码区。此外，LSC和SSC区域之间的差异大于IR区域之间的差异。单拷贝区域的序列分歧高于IR区域，而非编码区的分歧高于编码区。这些结果与之前在白头翁属中报告的结果相似。   

2、白头翁属cp基因组中的基因密码子使用

单核苷酸多态性（SNP）在CG序列中最为常见，C到T的多态性是最常见的转变，因为CG中的C通常被甲基化，并在自发去氨基化后变为胸腺嘧啶。一般来说，SNP是频率大于1%的单核苷酸变异。根据Grant等（1998）提出的标准，单倍型多样性的临界值为0.5，核苷酸多样性的临界值为0.005。两个值越高，种群多样性的程度越高。

叶绿体中的基因在功能上是重要的，并且可能在进化过程中受到选择。为了分析白头翁属cp基因组上的选择压力，我们计算了10种白头翁属物种编码基因的非同义/同义替换率（Ka/Ks）。Ka/Ks值高于1.0的基因应受到正向选择，并可能是功能适应的候选基因，而低于1.0的基因应受到负向选择。大多数基因的Ka/Ks值低于1.0（图5），反映出维持基因功能的选择压力。根据计算，只有ycf2的Ka/Ks > 1，而clpP、matK和ycf1的值在0.5-1之间。其余基因的值在0-0.5之间。已报道所有物种中参与光系统（psbD、psbE、psbF、psbI、psbJ、psbK、psbL、psbM、psbN、psbT、psbZ）、细胞色素b/f复合体（petB、petD、petG、petL、petN）和一些ATP合酶（atpB、atpE、atpF、atpH、atpI）的基因的Ka/Ks值接近0。高比率的基因为未分类基因（ycf1、ycf2）和与酶相关的基因（clpP、matK）。白头翁属的cp基因具有高度保守性。

3、白头翁属属的系统发育分析

研究构建了10种白头翁属物种的系统发育树，并用颜色编码以反映支系身份。其中，P. chinensis及其变种P. chinensis var. kissii首先聚成一支，然后与其变型P. chinensis f. alba聚在一起，这与之前基于形态学的分类一致。然而，P. cernua f. plumbea没有与P. cernua聚在一起，而是与P. dahurica聚在一起。此外，P. cernua与P. tongkangensis聚在一起，后者是与P. cernua杂交形成的天然杂交群体，基于随机扩增多态DNA（RAPD）和cpDNA的SNP分析，与K2p距离法的结果一致。P. cernua f. plumbea的归属及其与P. cernua和P. dahurica的关系仍需进一步确认和研究。蓝色分支的支系表示四个分布于中国的物种（P. chinensis、P. cernua、P. dahurica和P. turczaninovii），它们的根在省级及以上的药材标准中被记录为“白头翁”的来源。未来，结合化学成分分析结果，对白头翁属的系统发育关系分析将为中国“白头翁”药用资源的评估提供重要参考信息。   

新物种P. saxatilis与P. campanella聚成一支，但在系统发育上与形态上最相似的物种P. chinensis相距较远。考虑到整体形态，P. saxatilis在具有三出复叶和单生直立花方面与P. chinensis非常相似，但在花萼呈淡蓝色、白蓝色或白色（vs.紫色）和持久的2-2.5 cm（vs. 3.5-6.5 cm）长花柱方面有所不同。此外，系统发育上最接近的物种P. campanella也具有三出复叶，但下部小叶的形状与中央小叶的侧生裂片基本相同，呈羽状；花在开放前和开放时下垂；花萼呈蓝紫色至丁香色。白头翁属的形态差异主要反映在花的形态和叶特征上。具有下垂花和羽状分裂叶的物种在系统发育上源自具有直立花和掌状分裂叶的物种。

P. campanella分布于新疆西部，P. saxatilis现在发现于辽宁省，而P. chinensis广泛分布于中国东北（包括辽宁）、华北、四川等地。白头翁属的花粉粒有四种发芽孔类型，即三孔沟、全孔沟、全孔和二型花粉（具有三孔和二孔）。其中，P. chinensis为三孔沟型，P. campanella和P. saxatilis为全孔型。此外，每种类型的进化趋势如下：三孔沟→全孔沟→全孔。因此，探讨P. saxatilis的相对物种仍需进一步的数据支持和分析。

传统的形态学分类和DNA条形码旨在解决物种分类和鉴定的问题，以更有效地保护和可持续利用生物多样性资源。在本研究中，筛选了10个高变异区域序列用于构建系统发育树，但没有一个与cp基因系统发育树完全一致。这主要反映在P. campanella与P. saxatilis之间的系统发育关系差异上。与cp基因树结构一致性更高的树是基于ccsA_ndhD（图S2-A）、rps16_trnK-UUU（图8-A）和ccsA（图S2-C）。然而，具有相同高π值的trnY-GUA_trnD-GUC的分支结构不同。一个共同的问题是这些树的外群（Anemone tomentosa）没有很好地区分，但对属内鉴定没有显著影响。在选择的10个序列中，只有rbcL有效地鉴定了外群。其余选择的序列也有一定的鉴别率。一般来说，π值越高，通常与cp基因树和自展值的一致性越高。然而，具有最高π值的rps12-内含子（图S2-F）由于大多数分支的自展值为零而无法构建系统发育树。通过序列比对发现，序列高度一致，只有P. dahurica序列与其他序列差异明显。因此，rps12-内含子不适合作为白头翁属的条形码，但可以考虑用于P. dahurica的专属鉴定。   

当使用单一序列进行物种鉴定时，可能无法同时解决属间和属内差异等所有问题，因此仍有必要进行多序列组合和实验验证。目前，植物DNA条形码正从单一或少数DNA片段发展到多DNA片段、cp基因组数据等的组合，并已广泛应用于许多研究。特别是基因组测序技术的重大进展，使研究人员能够探索“基因组超级DNA条形码”。对于近缘物种，完整的cp基因可以提供更全面的基因差异信息，以实现有效鉴定。本研究分析了白头翁属的cp基因，并筛选出有效的DNA序列。这对白头翁属的物种分类和鉴定具有重要意义。

结论

本研究报告了一种新发现的濒危物种岩生白头翁（P. saxatilis）的cpDNA特征，并比较了同属的10种植物的cpDNA。白头翁属的cpDNA在大小、GC含量、基因序列和功能上表现出高度相似性。通过一系列比较，确定与P. saxatilis最近的物种是P. campanella，这与基于花粉粒特征得出的结论一致，但与根据形态特征确定的P. chinensis不同。上述结果对白头翁属的鉴定和分类研究具有重要意义。

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