背景导读
Viola philippica Cav. 是“紫花地丁”的唯一来源植物，这是一种被用作治疗急性化脓性感染的解热解毒剂等中药。从历史上看，许多开着紫罗兰花的堇菜品种被混淆为“紫花地丁”。由于其高度相似的形态特征，堇菜属已被公认为分类困难的属。
堇菜属物种之间不明确的系统发育关系和高度相似的形态特征限制了紫花地丁种质资源的选育和开发。DNA条形码是一种新兴的分子识别和分类技术，它显著提高了草药的安全性和有效性。DNA条形码不受形态特征或生理条件的限制，允许在没有专业分类学知识的情况下进行物种鉴定。随着高通量测序技术的快速发展，叶绿体基因组作为一种超级条形码被广泛应用，它可以为解决药用植物的系统发育关系和鉴定提供有效的信息。
在本研究通过叶绿体基因组分析，来鉴定Viola物种，特别是紫花地丁。此外，在高度分化的cp基因组区域中筛选分子标记，用于Viola的鉴定和系统发育研究。
叶绿体基因组在中药紫花地丁（Viola philippica）鉴定中的应用
原名：Application of chloroplast genome in the identification of Traditional Chinese Medicine Viola philippica
杂志：BMC Genomics 影响因子：4.547 发表时间：2022
材料方法
1、研究对象
本研究对所有常见的紫花地丁样本采样，对获得的19个样本的叶绿体进行了新的测序，同时从GenBank下载已有的5个质体基因组。通过Geneious v8.0.2用于注释更正，同时对17个完整质体的基因组大小、GC含量、基因数量和内含子数量进行了总结。
2、研究内容
IRs区的扩张和收缩、重复序列和SSRs鉴定、比较基因组分化热点分析、系统进化分析、可变位点的选择分析以及形态学研究等。
研究目的
1、比较采样的堇菜属物种的叶绿体基因组结构；
2、找到一种有效的方法来区分紫花地丁和其他Viola物种；
3、通过完整的质体序列和高度分化的序列，解决Viola物种内的亚属关系，特别是Adnetae、Pinnatae和Bilobatae。
主要结果
1、堇菜属叶绿体基因组结构
目前的所有已被准确鉴定的Viola物种都具有相似的cp基因组结构、基因顺序和方向。质体大小范围156483-158940bp（表1）。17个Viola物种的cp基因组具有高度保守的四分体结构，包括LSC区（85364-87250bp）、SSC区（16558-18008bp）和一对IRs（26404-27404bp），GC的总含量约为36%。在17个Viola物种中注释了128个基因，其中110个是独特的，由76个蛋白质编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因组成。cp基因组的编码基因根据其功能分为四类：光合作用基因、自我复制基因、其他生物合成基因和一些功能未知的基因。
表1 17个堇菜属cp基因组结构
图1 Viola物种的形态学和cp基因组图谱。
2、堇菜属cp基因组的结构比较
IR/SC连接的位置在所有cp基因组中都是保守的。一般来说，rps19基因在LSC/IRb（JLB）的连接处延伸2-73bp进入IRs，导致该基因在IRa区域的3'-端重复。ndhF基因位于SSC中，距离SSC/IRb（JSB）边界3-33bp。在所有cp基因组中，SSC/IRa（JSA）连接位于ycf1基因内，在IRb区有1091至1866bp的重复。此外，trnH基因均位于LSC区，trnH-GUG与LSC/IRa（JLA）边界之间的距离从26到85bp不等。
在17个Viola cp基因组中总共检测到729个重复序列。结果表明，紫花地丁的重复次数为46次，包括19次正向重复、8次反向重复、1次互补重复和18次回文重复。研究总共确定了450个SSR；Viola cp基因组中最丰富的重复序列是单核苷酸重复序列，其次是二核苷酸和四核苷酸重复序列。最常见的单核苷酸重复类型是A/T，所有的二核苷酸重复都由AT/TA组成。
3、高变区的识别
在所有17个Viola物种中都发现了高度的序列相似性。然而，观察到LSC和SSC比IR区域更具发散性。此外，基因间区比编码区表现出更大的差异（图2A）。计算核苷酸多样性（Pi）值，其值从0到0.06602不等（图2B）。在以下基因组区域检测到高序列差异：matK、ndhF、ycf1、rpl22、rps15、ndhA、petN和psbM等，可作为开发Viola物种系统发育分析的关键分子标记的候选。
图2 17个Viola cp基因组的序列多态性
4、叶绿体基因组用于鉴定紫花地丁
使用cp基因组和16个高度分化的基因构建系统发育树（图S3）。紫花地丁1号和紫花地丁2号与所有堇菜属物种聚在一起，结果表明，紫华地丁1号与V. yezoensis形成的一个分支。紫华地丁2号聚类在V. philippica1号和V. philippica 2号之间。
与其他Viola物种相比，V. philippica的ndhF、rpl22和ycf1中存在四个物种特异性可变位点（图3）。四对特异性引物的核苷酸序列如图4所示，所有个体的扩增产物约为350bp（图4）。Sanger测序结果和二代测序结果一致。
图3 V. philippica中ndhF、rpl22和ycf1特异性变异位点
图4 在14个新测序的Viola物种中四个特异性引物序列和电泳图谱
5、Viola的基础关系
对堇菜属物种形态特征的比较表明，这17个物种可分为5个分支，包括Viola、Pinnatae、Adnatae、Trigonocarpae和Bilobatae（图5）。根据所有ML和BI树的拓扑结构，所有17个物种被进一步分为这五个单系群（图6）。值得注意的是，当比较形态学和cp基因组树时，所有五个分支中的物种都是相同的。ML和BI树的拓扑结构对于完整的cp基因组和具有高度分化的序列进化树是高度一致的（图6）。
图5 17种堇菜属物种的形态聚类
图6 基于24个样本的完整cp基因组的最大似然（ML）和贝叶斯（BI）系统发育树
结论
在目前的研究中，所有堇菜属cp基因组具有高度相似的基因含量和顺序。基于完整的cp基因组和高度分化的基因序列ML和BI进化树的拓扑结构都是高度一致。形态学特征、cp基因组系统发育和物种特异性可变位点可用于区分“紫华地丁”的唯一来源植物V. philippica与其他堇菜属物种，特别是其混淆品。此外，我们还提出，准确鉴定V. philippica最有利的时间是开花期。这项研究为V. philippica的物种鉴定和种质资源改良提供了宝贵的数据，这可能有助于叶绿体基因组超级条形码在中药鉴定中的应用，为今后研究Viola物种的系统发育进化和安全的医学应用奠定基础。
温馨说明
1、惠通生物针对叶绿体、线粒体测序项目组装结果准确，可以提供定制化高级分析，欢迎联系我们获取小基因组文章专业解决方案，助力文章发表。
2、惠通生物小基因组服务电话：18926264030
欢迎关注物种分类及进化研究
深圳市惠通生物科技有限公司，成立于2016年，技术成员在生物信息方面均有八年以上分析经验，在小基因组项目（叶绿体、线粒体、病毒）上形成强劲技术优势并可提供定制化高级分析内容。成立至今已服务客户单位100余家包括中国科学院植物研究所、中国科学院昆明植物研究所、华南农业大学、浙江大学、中国人民解放军疾病预防控制中心、武汉水生生物研究所等科研单位。合作老师发表小基因组SCI文章逾100篇，发表在《forests》、《 Frontiers in Plant Science》、《Frontiers in Microbiology》、《molecules》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《Plant Genome》、《International Journal of Molecular Sciences》、《Infectious Diseases of Poverty》、《peerJ》、《genes》、《frontiers in Veterinary Science》《Frontiers in Immunology》等杂志。
