▷2024/12/31
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本文导读
胶质母细胞瘤（GBM）是一种原发性恶性脑肿瘤，治疗选择有限。目前有前景的方法是局部给药，但疗效受到药物有限扩散和保留的阻碍。
本研究开发了一种双敏感纳米颗粒（Dual-NP）系统，该系统由树突大分子和葡聚糖 NP 形成，由双敏感 [基质金属蛋白酶（MMP）和pH] 接头结合，旨在肿瘤微环境中快速分解。
分解促使纳米凝胶通过Schiff碱反应原位形成，延长双NP保留并随着时间的推移释放小的阿霉素（Dox）偶联的树状大分子NP。双NPs能够深入3D球状体模型，在GBM 原位小鼠模型中单次瘤内注射长达6天后仍可在肿瘤部位检测到。与单独使用未经治疗或Dox偶联的树状大分子NP相比，肿瘤组织中双NP的长期存在导致肿瘤生长显着延迟，总体生存率增加。这种Dual-NP系统有可能提供一系列有效治疗GBM和其他实体瘤的治疗方法。
成果题名：Matrix Metalloproteinase- and pH-Sensitive Nanoparticle System Enhances Drug Retention and Penetration in Glioblastoma
发表期刊：《ACS Nano》
成果介绍
1、双敏感纳米颗粒（Dual-NP）的设计
作者开发了由Dox偶联的Dend-NPs和Dextran-NPs组成的双NPs，用于延长药物滞留和增强肿瘤渗透性，以治疗GBM。工程化的NP最初通过可切割接头连接，该接头设计用于在肿瘤部位裂解，以原位形成纳米凝胶以延长保留时间。该平台充当加载Dox的治疗性Dend-NP的储存库，作为一种模型药物，随着时间的推移持续地释放，从而改善药物渗透。为了形成双NPs，使用了Dend-NPs和Dextran-NPs，其官能团胺和醛基受到双敏感肽接头（DSPL）的保护，该接头设计为在低pH值下裂解，并受到TME中存在的MMP的保护。合成DSPL以包含MMP可切割肽VPLSLYSG、以及切割时纳米凝胶形成所必需的四个赖氨酸残基。聚乙二醇化和氧化的葡聚糖-NPs作为骨架，通过DSPL连接多个Dend-NPs。Dend-NP旨在有效递送不同类型的药物，这些药物可以通过巯基偶联与树突大分子马来酰亚胺基团轻松偶联。
图1 双敏感纳米颗粒（Dual-NP）设计可在胶质母细胞瘤中延长药物保留和深部肿瘤渗透
2、葡聚糖纳米颗粒的合成和表征
葡聚糖-NPs分三个不同的步骤配制。首先，右旋糖酐胆固醇NP（DexChol-NP）通过在水溶液中自组装形成，其中胆固醇氯甲酸酯通过氯甲酸酯基团与右旋糖酐单体的羟基亲核取代而与线性葡聚糖结合。向葡聚糖中添加胆固醇导致聚合物疏水性增加，促进自组装纳米颗粒的形成。DexChol-NP通过高碘酸钠（NaIO4)进一步修饰。右旋糖酐、DexChol和DexChol氧化（DexCholOx）分子结构表征为1HNMR。DexChol和DexCholOx的化学结构分别通过胆固醇分子或醛基的存在来证实。DexCholOx-NPs表面的醛残基进一步用胺官能化聚乙二醇（NH2-PEG）和胺官能化（NH2-link）连接二苯并环辛炔（NH2-（PEG）4-DBCO）连接器（称为DBCO-link），形成亚胺键。选择0.5：0.5的PEG-linker-to-DBCO-linker比例以保持右旋糖酐-NPs和Dend-NPs的正确比例，这对于最终纳米凝胶的形成至关重要。所得纳米颗粒显示出低多分散性（0.194±0.01），平均尺寸为152±0.97nm，表面负电荷为-13.7±1.01mV。
图2 pH敏感的葡聚糖-NP的合成
3、树枝状聚合物纳米颗粒的合成和表征
树状聚合物已被用作递送药物和核酸的有效载体，通过将伯树枝状大分子胺与琥珀酰亚胺基接头偶联，将Dend-NP与双功能琥珀酰亚胺-[（N-马来酰亚胺基丙酰胺基）二甘醇]酯接头SM（PEG）2偶联。添加半胱氨酸，通过巯基-马来酰亚胺反应将胺基再生到马来酰亚胺活化的PEG树枝状聚合物上，从而实现特异性和受控的Dox-乌头酰偶联。同时，Dox-乌头酰用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，并逐滴添加到Dend-NP中。紫外-可见光谱显示每个Dend-NP平均有7个Dox分子。紫外-可见光测量的相同浓度的Dox下，与游离药物相比，与树状大分子偶联的药物的内在荧光（例如：470nm）降低了6倍，证实了成功的药物偶联。
接下来，使用含有三个赖氨酸的CK3肽（NH2-CKKK-CONH2）修饰树状聚合物，通过再生和增强伯胺基团和DSPL肽来促进纳米凝胶的形成。此外，向树状聚合物或其他纳米颗粒中添加聚赖氨酸肽会增加它们的生物相容性和细胞内化。肽接头通过马来酰亚胺和还原巯基反应形成硫醚键而连接。肽偶联后，所得Dend-NPs的平均尺寸为14.5±0.2nm，分散性低。此外，肽偶联将Dend-NPs的总表面电荷从2.39±0.35mV增加到30.7±3.62mV。
图3 Dox负载的MMP敏感Dend-NP的合成
4、双NP的合成可在体外形成纳米凝胶
两种NP的偶联是通过无铜点击化学反应进行的，其中右旋糖酐-NP的DBCO部分与DSPL修饰的Dend-NP的叠氮化物基团形成稳定的键。所得制剂（Dual-NPs）由单个葡聚糖-NP（162±0.97nm）组成，周围环绕着许多含有治疗剂Dox的小Dend-NPs（14.5±0.20nm）。通过以不同的w/w比例（从1：1到0.05：1）混合Dend-NPs和Dextran-NPs来分析含有不同量Dend-NPs的右旋糖酐-NPs。由于Dextran-NP和Dend-NP分别存在负电荷和正表面电荷，因此在施加电场时，它们会向琼脂糖凝胶中的相反磁极运行。由DLS确定的表面电荷差异也证实了双NP的形成。结果表明，双NPs呈现13.7±1.7mV的表面电荷，介于Dend-NPs（30.7mV）和葡聚糖-NPs（−13.7mV）获得的zeta电位之间。此外，当Dend-NPs共价连接到葡聚糖-NPs上时，观察到尺寸略有增加（169±3nm），形成双NPs。
体外结果显示，在MMP-9酶存在下，前8小时内释放60%，前48小时内释放80%。相比之下，在没有MMP-9酶的情况下未观察到Cy3释放。Cy5-N的释放量在pH6.8时显著增加，而前24小时内的pH值为7.4。相比之下，当将非pH敏感接头（对照）用于葡聚糖-NP制剂时，观察到最小的释放。亚胺键的快速水解和MMP接头的裂解对于促进TME区域的选择性和快速纳米凝胶形成至关重要。MMP敏感接头的裂解以及pH敏感的DBCO接头的水解将暴露Dend-NPs和Dextran-NPs的胺基和醛基，从而实现席夫碱反应
图4 制备双NPs在高基质金属蛋白酶浓度和酸性pH条件下快速形成纳米凝胶
5、Dual-NP在3DGBM球状体模型中显示保留、渗透和治疗效果
为了评估Dual-NPs的肿瘤渗透和体外摄取，使用GL261细胞通过使用超低附着板离心形成肿瘤球体。培养6天后，球体的pH值约为7，模拟体内GBM条件。然后用荧光标记的Dual-NPs（AF594标记的Dend-NPs）处理球体24h。Dual-NP处理后，用Hoechst33342对球状体进行染色，形成同心核染色荧光梯度，在细胞解离和流式细胞术分析之后，可以根据细胞荧光强度将其分成三个同心部分。核心切片（约占总细胞群的10%）代表球状体中心的弱染色细胞;中间部分（约占总细胞群的60%）表示球状体表面和核心之间的细胞;表面切片（约占总细胞群的30%）表示球状体外部最亮的细胞。定量分析表明，MMP-9预处理的Dual-NP组在所有球状体段（核心、中间和表面）中产生的阳性细胞百分比高于Dual-NP组。这种差异在中间和核心切片中更为显着，表明在DSPL切割时，较小尺寸的Dend-NPs更深入地渗透到肿瘤球体中。
接下来评估Dual-NP在3D球体中的保留和抗肿瘤作用。结果表明，随着时间的推移，Dend-NPs会从球体边缘形成的纳米凝胶中释放出来，从而增强NPs对球体中心的渗透。与单独的Dual-NP相比，用含有MMP-9的Dual-NP处理的球状体显示细胞活力降低了2倍。这些结果表明，在MMP-9存在的情况下，Dual-NP在3D球体生长中引起了显着的延迟和体外细胞毒反应，这归因于其携带化疗药物的Dend-NP的保留和渗透。
图5 在MMP-9酶存在下，双NPs在GL261细胞球体中的渗透性增加
6、TME中增强的双NP保留可在体内诱导有效的GBM抗肿瘤反应
接下来，评估了双NP在原位GBM小鼠模型中的性能。使用GL261-荧光素酶细胞将肿瘤植入C57BL/6小鼠的左半球，并通过IVIS监测肿瘤生长。第10天，肿瘤接种后小鼠瘤内注射荧光标记的Dual-NPs和Dend-NPs，Dox剂量为15μg，通过IVIS测定其生物分布（BD）和保留。给药后48小时，双NPs保留在大脑中，其他器官中没有明显的存在。Dual-NPs在注射部位的荧光强度明显高于Dend-NPs。注射2天后，与Dend-NP相比，Dual-NPs的保留率增加了2倍。此外，注射后6天，40%的双NPs仍然存在于TME中，而保留不到10%的游离Dend-NPs。与Dend-NP、游离Dox和未治疗组相比，双NPs在肿瘤组织中的长期存在导致肿瘤生长显着延迟并且总体生存率增加。总体而言，该技术能够靶向地随着时间的推移递送治疗药物，同时能够有效地摄取到细胞中。Dend-NP的多价性质和小尺寸使其能够偶联任何药物，同时增强药物向细胞中的扩散和摄取。双NP仅在与癌组织相互作用时形成纳米凝胶，在注射过程中保持纳米颗粒形式。
图6 TME中的双NP保留可减少胶质母细胞瘤中的肿瘤生长
总
结
本研究开发了由Dend-NPs和Dextran-NPs形成的双敏感纳米颗粒（Dual-NPs），它们在TME特异性条件下分解，允许原位形成纳米凝胶，延长保留时间，同时随着时间的推移可持续释放NP偶联治疗剂。在体外，证明MMP-9处理的Dual-NPs由于与GL261球体表面的相互作用而有效地形成纳米凝胶。在GL261球体中使用MMP-9处理的Dual-NPs会增加Dend-NP渗透率和更高的细胞毒性。使用GBM小鼠模型在体内观察到类似的结果，其中双NPs保留超过6天，导致肿瘤生长显着延迟和小鼠存活率增加。Dual-NPs利用TME的独特特性来安全有效地递送药物。将来可能通过利用两种不同类型的NP来提供联合疗法。
文章来源：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c03409
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