分子成像能够在细胞和分子水平上对体内特定的生化活动进行定量可视化，用于研究生物过程、疾病诊断或监测治疗。准确的分子成像非常需要具有高灵敏度和可靠成像信号定量的方法，以实现对无论是小分子还是低浓度检测。然而，现有常用的分子成像方式存在一些内在的局限性，例如灵敏度差（用于磁共振成像）、电离辐射（用于正电子发射断层扫描和 X 射线计算机断层扫描）和强背景信号（用于荧光成像）。余辉发光，也称为长持续发光，在光激发停止后仍发光。由于不需要实时光激发，余辉发光可以消除生物组织的自发荧光，大大提高了信噪比 （SBR）。因此，余辉发光有望在体内实现各种生物医学应用。到目前为止，一些无机纳米颗粒（如 ZnGa1.995Cr0.005O4和镧系元素掺杂的 NaYbF4上转换纳米粒子）已被开发用于产生余辉发光。然而，它们在体内的适用性可能会受到重金属离子潜在泄漏相关的全身毒性担忧的影响。与无机纳米颗粒相比，有机余辉纳米颗粒在生物相容性和生物降解性方面更适合生物医学应用。然而，它们的“光余辉转换性能”很差，需要高功率密度的激光激发并且采集时间长。此外，由于最大强度衰减（称为“余辉光漂白”），它们不适合重复成像。
近日，湖南大学化学化工学院化学/生物传感与化学计量学国家重点实验室的张晓兵教授与宋国胜教授率领团队报道了一种基于富电子三蒽衍生物的纳米粒子，其可以在普光下以超低功率进行超亮的余辉发光。超亮余辉允许对自然行为的小鼠进行深层组织成像（长达 6 cm），进行超快余辉成像（采集时间低至 0.01 s），光漂白可以忽略不计。即使在重新激发超过 15 个周期后，皮下和原位肿瘤以及颈动脉斑块仍可准确实现可视化。应用示例表面，颗粒酶B 响应性余辉纳米颗粒允许在治疗监测的背景下跟踪颗粒酶-B 活性。有机余辉纳米颗粒的高灵敏度和可忽略不计的光漂白为生理病理过程的实时体内监测提供了优势。
余辉发光分子的设计：
光动力过程涉及光敏剂的施用，光敏剂在氧气存在下照射时产生活性氧 （ROS）。ROS 的产生涉及 I 型电子转移和 II 型能量转移。对于 II 型光敏剂，在光照射下，它会从基态（S0）跃迁为激发的单重态（S1），然后经历系统间交叉（ISC）到激发的三重态（T1)。T1态的能量通过三重态-三重态能量转移转移到周围的3O2，从而产生单线态氧（1O2）。在有机余辉发光的背景下，大多数余辉分子都是II型光敏剂，能够通过能量转移途径产生1O2。然而，产生1O2需要II型光敏剂的三重态能量超过3O2和1O2之间的能量势垒。由于低三重态能量导致的1O2产量不足会严重限制中间体的产生和探针的余辉发光强度。
相比之下，I型光敏剂在照射时将电子转移到周围的3O2上，从而产生超氧自由基（O2•–）。这种电子转移途径不受3O2和1O2之间的三重态能垒的限制。因此作者团队利用I型电子转移机制来补充II型能量转移，以提高中间体的生产效率，从而增加余辉发光强度。将富含电子的蒽掺入余辉分子中，设计并合成了三蒽衍生物（TAD）。TAD分子在邻位和间位被烷氧基取代，以增强其富电子性能。作为比较合成了二蒽衍生物（DAPD）。对于TAD的余辉发光机制，在I型余辉反应中，电子转移导致形成O2•−和TAD的自由基阳离子（TAD•+）。在II型余辉反应中，能量转移导致1O2和TAD分子的产生。假设I型电子转移途径将增加TAD分子与3O2的反应性，导致中间体（内过氧化物，EPO）的形成，因为II型能量转移途径中光敏剂的三重态能量不会阻碍O2•−的产生。随后，这些环氧丙烷发生O-O键断裂，形成芳香羰基化合物，并通过CIEEL自发产生光子。
使用 PSMA 和 DSPE-PEG 将TAD 或 DAPD 分子转化为水溶性纳米颗粒。TEM 分析显示，基于 TAD 的纳米颗粒 （TAD-NPs） 表现出单分散特性，平均流体动力学尺寸为 ~40 nm。DLS确定的 TAD-NPs 的流体动力学直径为~60 nm。在生物发光模式下使用 IVIS Lumina XR 成像系统捕获 TAD-NPs 和 DAPD-NPs 的余辉发光，在停止白光照射后，TAD-NPs 表现出比 DAPD-NPs 更强的发光。此外，TAD-NP 的余辉光谱与它们在 600-750 nm 范围内的荧光光谱非常相似。
图 余辉纳米颗粒（TAD-NPs 和 DAPD-NPs）的合成和表征
余辉发光的机理：
研究了联合I型电子转移途径和II型能量转移途径增强余辉发光的机制。ESR光谱显示，仅在光照下观察到TAD NP的O2•−，而单独在黑暗或光照下的TAD NP不会产生O2•−。此外，添加超氧化物歧化酶（SOD、O2•−清除剂）会导致TAD NP产生的O2•−被消耗。与异构体DAPD分子（-0.12 V）相比，TAD分子的第一氧化电位（-0.15 V）较低，表明TAD分子比DAPD分子更有可能失去电子。为了验证增强的余辉信号与I型电子转移途径的关系，当将SOD添加到TAD-NP溶液中时，余辉发光减少了26.8%。此外，SOSG测量了光照射下溶液中TAD NP产生大量1O2。与单独PBS、H2O2或Na2MoO4相比，1O2与TAD NP的孵育导致更高的发光强度。添加捕获1O2的清除剂抑制了TAD NP的余辉发光，证实了1O2通过II型能量转移途径参与余辉发光。
为了进一步了解余辉发光过程中EPO的形成过程，采用了MALDI-TOF MS测量和DFT计算以确定EPO的形成并预测其相对能量。当暴露在光和空气中时，TAD分子与O2•−或1O2发生一系列环加成反应，导致EPOs II-VI的形成。当TAD分子被一个O2•−或1O2分子加性氧化时，发生了EPO II或III的形成。由于EPOs II或III中的反应位点过剩，将与额外的O2•−或1O2分子反应以产生EPOs IV、V或VI。EPOs II和IV的能量略低于EPOs III和V的能量，这表明在渐进的环加成反应中产生EPOs II、IV的可能性更高。FTIR检测到TAD片段在1735 cm-1处存在羰基特征峰，证实了TAD被光氧化成各种羰基化合物。
基于上述结果，提出了TAD-NPs余辉发光的可能机制。TAD NPs经历了两种不同的光化学反应途径，即I型电子转移途径和II能量转移途径，以产生EPO和随后的余辉发光。在I型途径中，TAD分子被光激发并将电子转移到3O2上，产生O2•−和TAD•+。在II型途径中，TAD分子的三重态将能量传递给3O2，产生1O2。TAD或TAD•+提供了捕获O2•−或1O2的反应位点，导致EPOs的形成。I型途径显著增加了TAD分子与3O2的反应性，导致大量EPOs的形成。然后，EPOs经历了O-O裂解，通过CIEEL机制将纳米粒子内附近的TAD激活到激发态。当激发的TAD从激发的单线态（S1）弛豫到基态（S0）时，发出余辉发光。
图TAD-NPs 的余辉发光机制。
余辉发光的性能与优化：
优化两亲性聚合物对TAD NP余辉发光的影响，发现与其他聚合物涂层组相比，PSMA+DSPE-PEG共涂层产生了更高的余辉发光。通过对荧光强度、O2•−和1O2生成的分析，在PSMA+DSPE-PEG共涂覆TAD NP的情况下，O2•−、1O2生成量的增加和荧光发射都有助于获得最高的余辉发光强度。与MEHPPV NP、蒽、苝衍生物和萘衍生物基纳米粒子相比，TAD NP表现出明显更高的余辉发光强度。TAD NP的余辉发光强度比MEHPPV NP高约500倍。
在生物相关条件下，TAD NP的余辉发光在激发光停止后持续60分钟以上。随着光照功率密度从1.4 mW cm−2增加到15 mW cm-2，TAD NP表现出更亮的余辉发光。TAD NP的余辉发光强度随着照射时间的增加而不断增强，在照射8秒时达到最大值。TAD NP可以被超低功率密度的白光源有效激发，如实验室环境照明（~58μW cm−2），并且仍然表现出明亮的余辉。这种超低功率密度的激发光远低于直射阳光的强度，提供了一种安全的激发条件，避免了光致组织损伤。TAD-NPs的超亮余辉发光有助于缩短信号采集时间。在0.01秒的采集时间内，检测到TAD NP的余辉发光。在相同条件下，没有从MEHPPV NP中检测到明显的余辉信号。
激发光的超低功率密度最大限度地避免了余辉分子的化学分解，从而能够通过多次光照射对余辉信号进行再呈像。使用6.6 mW cm-1的光照1秒超过30个周期，TAD NP的最大余辉发光强度没有明显衰减。这种可忽略的余辉光漂白可归因于高效的光余辉转换和激发光的超低功率密度，这确保了在长达数小时的重复分子成像过程中对余辉信号的准确量化。尽管余辉和荧光信号都随着组织厚度的增加而降低，但与荧光相比，余辉发光表现出更高的SBR和更大的组织穿透力（高达6.0 cm），这主要是由于余辉成像过程中组织没有自发荧光。
图 余辉纳米颗粒的发光特性
肿瘤和颈动脉斑块的余辉成像：
为了证明TAD NP作为诊断探针的适用性，在BALB/c小鼠皮下注射CT-26肿瘤后，进行了余辉发光成像。当暴露于室内光、智能手机光或手电筒光时，在肿瘤部位检测到强烈的余辉发光。在15个周期的光照射过程中，最大余辉发光强度没有明显衰减，表明TAD NP在体内表现出有效的再激发和可忽略的余辉光漂白能力。此外，当肿瘤内注射的TAD NP（20×）暴露于6.6 mW cm−2的白光下时，余辉信号达到~7×107 ps−1，高于MEHPPV NP（20倍）。即使在较低的TAD NP肿瘤内注射剂量（1倍）下，余辉信号强度仍比MEHPPV NP（20倍）高约4倍。
动物在自然状态下的实时成像对于加深对脑功能、学习行为和疾病病理学之间相互作用的理解至关重要。然而，捕捉不受约束和清醒动物的清晰发光图像极其困难，主要是由于运动伪影和短暂采集窗口内发光信号不足。TAD NP为这些问题提供了一种有前景的解决方案，提供了异常明亮的发光，能够在短短0.01秒的超短采集时间内提供足够的余辉信号。因此，探索了TAD NP在超快余辉成像中捕捉自然行为动物动态的潜力。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最常见、最具侵袭性的恶性肿瘤，临床5年生存率为4-5%。因此，GBM的精确成像对于早期诊断至关重要。采用TAD NP对携带GBM的原位小鼠进行成像。静脉注射TAD NP后，原位携带GBM的小鼠头部区域表现出动态增强的余辉信号，而健康小鼠头部没有明显的余辉信号。因此，TAD-NPs可以通过EPR效应穿透原位胶质瘤，实现胶质瘤肿瘤的高灵敏度和精确成像。
血管系统功能障碍是全球严重健康问题的主要原因之一。颈动脉壁上的斑块积聚会导致管腔狭窄、大脑供血减少，甚至因斑块破裂而导致急性中风。接下来使用TAD NP通过静脉注射对小鼠颈动脉中的斑块进行成像。小鼠的余辉和荧光图像显示，与正常颈动脉相比，有斑块的颈动脉的信号强度明显更高。这些结果表明，TAD-NPs可以靶向颈动脉病变，并为活体小鼠的颈动脉斑块提供敏感和非侵入性的余辉成像。
图肿瘤和颈动脉斑块的体内余辉成像
体内化疗后免疫相关余辉成像：
免疫治疗期间免疫细胞活性的动态成像可以直接监测肿瘤对免疫治疗的免疫反应。颗粒酶B是一种在癌症免疫反应过程中由细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞释放的丝氨酸蛋白酶，可以在免疫治疗过程中观察到追踪免疫活性。设计、合成并表征了一种基于功能活性的颗粒酶B余辉纳米探针（TAD-BHQ）。纳米探针由颗粒酶B可清除肽序列与发光体TAD-NPs和淬灭剂BHQ-3结合而成。发光体-猝灭剂对表现出光谱重叠，导致在空间受限（“OFF”状态）时通过余辉共振能量转移（ARET）有效地猝灭发光。在颗粒酶B的存在下，TAD NP和BHQ-3之间的IEFD肽被切割，减少了ARET，导致余辉发光（“ON”状态）的恢复。因此，随着颗粒酶B浓度的增加，观察到余辉发光强度逐渐增加。
使用皮下携带CT-26肿瘤的小鼠模型验证了TAD-BHQ对颗粒酶B进行体内实时余辉成像的能力。对小鼠施用了三种化疗药物，包括Navoximod、PD-1/PD-L1抑制剂和BEC。这些化疗药物主要在肿瘤微环境中起作用，促进CD8+T细胞或NK细胞浸润肿瘤。以BEC治疗的小鼠为例，注射TAD-BHQ后，肿瘤部位的余辉和荧光信号逐渐增加。在注射TAD-BHQ后6小时，在化疗药物治疗的小鼠肿瘤部位观察到强烈的余辉信号。此外，与单次注射相比，多次注射BEC会产生更强的余辉信号，表明化疗剂量依赖性免疫反应。
图 体内化疗后免疫相关余辉成像
放疗和免疫检查点阻断治疗后的余辉成像：
放射治疗（RT）在临床中广泛用于癌症患者治疗。电离辐射可以通过各种机制刺激免疫系统，例如增加受影响细胞中主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的表达，减少T淋巴细胞中的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）/细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），以及诱导免疫原性细胞死亡。因此，将免疫检查点抑制剂与RT结合已被证明可以提高免疫反应率。利用TAD-BHQ通过追踪颗粒酶B水平来评估接受RT联合抗PD-L1治疗的小鼠的免疫反应。注射TAD-BHQ后，用抗PD-L1+RT治疗的小鼠在肿瘤部位表现出余辉信号的动态增强。与用PBS治疗的肿瘤相比，用抗PD-L1、RT或抗PD-L1+RT治疗的肿瘤显示出更高的余辉信号。
接下来，使用免疫荧光染色和流式细胞术分析测量了颗粒酶B的表达水平以及肿瘤中CD8+T细胞和NK细胞的数量。这些结果表明，与RT、抗PD-L1或PBS治疗相比，抗PD-L1+RT治疗导致CD8+T细胞和NK细胞的浸润增加，以及颗粒酶B在肿瘤中的表达水平升高。这一发现证实了TAD-BHQ的余辉激活是由于肿瘤中颗粒酶B水平的增加。此外，观察到治疗后肿瘤部位CD8+T细胞和NK细胞中的余辉信号与颗粒酶B表达之间存在很强的相关性。因此，TAD-BHQ可以在RT和/或免疫检查点阻断治疗期间评估活体小鼠的实时免疫激活。
图 体内放疗和免疫检查点阻断治疗后的余辉成像
小结：
作者团队开发了基于三蒽衍生物的纳米粒子作为余辉发光纳米探针，用于高灵敏度、安全、准确和动态成像。TAD NP通过电子转移途径（I型余辉反应）和增强的能量转移途径（II型余晖反应）表现出比MEHPPV NP高得多的余辉发光强度，从而能够进行深层组织成像（高达6.0 cm）。TAD-NPs被超低功率密度的光照射激发，即使在15个激发周期后，最大余辉强度也没有明显衰减。这种超亮的余辉和可忽略的光漂白使TAD NP能够实现皮下肿瘤、原位胶质瘤、原位胰腺肿瘤和颈动脉斑块的可重复、准确和纵向成像。重要的是，来自TAD NP的余辉信号可以在短至0.01秒的采集时间内捕获，从而能够对患有皮下肿瘤的无约束小鼠进行超快余辉成像，并为癫痫、中风、阿尔茨海默病和帕金森病等神经疾病的病理生理机制提供潜在的见解。由于缺乏实时激发，与活体动物的荧光成像相比，余辉成像的SBR得到了改善。此外，TAD-NPs的工程化促进了智能可激活余辉纳米探针（TAD-BHQ）的开发，用于通过成像颗粒酶B直接监测免疫疗法的疗效。具体来说，TAD-BHQ的余辉发光在化疗、放疗和/或免疫检查点阻断治疗期间被颗粒酶B激活，从而能够对小鼠中基于T细胞或NK细胞的免疫疗法进行动态和准确的成像。
参考文献：
Youjuan Wang, Jing Guo, Muchao Chen, et al. Ultrabright and ultrafast afterglow imaging in vivo via nanoparticles made of trianthracene derivatives. Nat Biomed Eng. 2024 Oct 29.
https://www.nature.com/articles/s41551-024-01274-8
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