多基因突变检测在甲状腺穿刺细胞学辅助诊断中的应用

张彦祺, 赵焕, 赵琳琳, 等. 多基因突变检测在甲状腺穿刺细胞学辅助诊断中的应用[J]. 中华肿瘤杂志, 2024, 46(11):1049-1057. DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20240225-00084.

 摘   要 

目的

评价9基因突变检测作为细胞学诊断不明确甲状腺病变的鉴别诊断方法和甲状腺细针穿刺细胞学检查的平行诊断方法的意义。

方法

2014年12月至2021年4月在中国医学科学院肿瘤医院行甲状腺细针穿刺细胞学检查的544例患者的579个甲状腺结节，收集其细胞学诊断后剩余的液基细胞学样本，采用下一代测序技术检测B-Raf原癌基因（BRAF）、成神经细胞瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（NRAS）、Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）、肿瘤蛋白p53（TP53）、端粒酶逆转录酶（TERT）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、鸟苷酸结合蛋白活性刺激肽（GNAS）和转染重排（RET）这9个基因任何癌症体细胞突变目录所收录位点的突变状态。以术后组织病理诊断和明确的细胞学诊断为金标准，比较9基因突变检测与BRAF V600E单基因检测的诊断效力。

结果

579个甲状腺结节中，细针穿刺细胞学诊断196个为Bethesda Ⅱ级，11个为Bethesda Ⅲ级，31个为Bethesda Ⅳ级，27个为Bethesda Ⅴ级，314个为Bethesda Ⅵ级；9基因突变检测阳性275个，突变率为47.5%。手术切除的329个甲状腺结节中，术后病理诊断30个为良性，5个为交界性，294个为恶性。将交界性结节视为恶性结节时，299个恶性结节中9基因的突变率由高到低依次为BRAF 62.21%（186/299），NRAS 5.02%（15/299），HRAS 1.00%（3/299），PIK3CA 0.67%（2/299），GNAS 0.67%（2/299），KRAS 0.33%（1/299），TP53 0.33%（1/299），TERT 0.33%（1/299），RET 0.00%（0/299）。9基因突变的恶性风险由高到低依次为BRAF 100%（186/186），PIK3CA 100.00%（2/2），GNAS 100.00%（2/2），TERT 100.00%（1/1），TP53 100.00%（1/1），NRAS 78.95%（15/19），HRAS 75.00%（3/4），KRAS 50.00%（1/2）。对于细胞学诊断为Bethesda Ⅲ～Ⅳ级（诊断不明确）的甲状腺结节，9基因突变检测诊断甲状腺癌的灵敏度为34.48%（10/29），特异度为61.54%（8/13），准确率为42.86%（18/42），而BRAF V600E单基因检测诊断甲状腺癌的灵敏度为0。对于细胞学诊断为Bethesda Ⅱ～Ⅵ级的甲状腺结节，9基因突变检测诊断甲状腺癌的灵敏度为68.83%（254/369），特异度为90.00%（189/210），准确率为76.51%（443/579），受试者工作特征曲线的曲线下面积（AUC）为0.79；BRAF V600E单基因检测诊断甲状腺癌的灵敏度为63.69%（235/369），特异度为99.52%（209/210），准确率为76.68%（444/579），AUC为0.82。BRAF V600E单基因检测的特异度高于9基因突变检测（ P＜0.01），而灵敏度、准确率和AUC与9基因突变检测差异无统计学意义（均 P＞0.05）。有4个诊断为甲状腺乳头状癌的结节和1个诊断为甲状腺滤泡癌的结节检测到提示不良预后的基因突变，其中2个结节检测到TERT与BRAF V600E共突变，2个结节检测到PIK3CA突变，1个结节检测到TP53突变。

结论

作为细胞学诊断不明确的甲状腺病变（Bethesda Ⅲ～Ⅳ级）的鉴别诊断方法时，9基因突变检测优于BRAF V600E单基因检测。作为甲状腺细针穿刺细胞学检查的平行诊断方法时，9基因突变检测的诊断效力与BRAF V600E单基因检测相当，并且9基因突变检测可以检测出个别提示不良预后的基因突变，对这些有特殊基因改变患者的临床管理有一定参考价值。

【关键词】甲状腺肿瘤；细针穿刺术；细胞学；基因突变检测；诊断

细针穿刺是一种快速、安全且可靠的检查方法，在甲状腺癌的术前诊断中发挥着关键作用。在进行细针穿刺的甲状腺病变中，约20%细胞学诊断不明确，包括按照甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统（the Bethesda System for Reporting Thyroid Cytology，TBSRTC）诊断为Bethesda Ⅲ级（意义不明确的非典型病变）和Bethesda Ⅳ级（滤泡性肿瘤）的病变，其平均恶性风险分别为28%和50%。

基因检测可以作为一种鉴别诊断方法，协助判断这些细胞学诊断不明确结节的恶性风险。另外，细胞学诊断的准确性会受到细胞学诊断医师经验的制约，基因检测是一种不依赖于医师经验的、较为客观的诊断方法，可作为常规细胞学检查的补充手段。B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）V600E突变是甲状腺癌最常见的基因改变，也是诊断甲状腺癌最常用的基因检测指标。但BRAF V600E单基因检测在细胞学诊断不明确病变中诊断甲状腺癌的灵敏度较低。一项meta分析显示，BRAF V600E单基因检测诊断Bethesda Ⅲ级病变中甲状腺癌的灵敏度仅为21%，诊断Bethesda Ⅳ级病变中甲状腺癌的灵敏度仅为9%。为了弥补BRAF V600E单基因检测对细胞学诊断不明确甲状腺结节行进一步良恶性判断时效力的不足，多基因检测应运而生。9基因突变检测基于下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术，其检测基因除BRAF外，还有在甲状腺癌中突变率仅次于BRAF的大鼠肉瘤（rat sarcoma，RAS）基因［包括成神经细胞瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（neuroblastoma rat sarcoma viral oncogene homolog，NRAS）、Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）］，与甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）密切相关的转染重排（rearranged during transfection，RET）基因，可提示不良预后的肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA），以及恶性风险达100%的鸟苷酸结合蛋白活性刺激肽（guanine nucleotide-binding protein α-stimulating activity polypeptide，GNAS）。在本研究中，我们对544例患者的579个甲状腺结节的细针穿刺样本进行了9基因突变检测，将该检测的结果与BRAF V600E单基因检测相比较，评估了9基因突变检测作为细胞学诊断不明确的甲状腺病变的鉴别诊断方法和作为甲状腺细针穿刺细胞学检查平行诊断方法的诊断效力。

资料与方法

1. 标本收集：收集2014年12月至2021年4月在中国医学科学院肿瘤医院行甲状腺细针穿刺制片后剩余的579个甲状腺结节的液基细胞学标本。入组标准：（1）细胞学诊断为Bethesda Ⅱ～Ⅵ级（因BethesdaⅠ级的标本为不满意标本，临床医师会要求患者重新进行细针穿刺，并且细胞量过少无法进行后续基因检测，故在本研究中未收集BethesdaⅠ级标本）；（2）经过常规液基细胞学制片后，标本瓶中至少还剩余10 ml液体标本；（3）有术后组织病理学诊断结果或明确的细胞学诊断结果（Bethesda Ⅱ级和Ⅵ级）。这579个甲状腺结节的细针穿刺标本来自544例患者，其中男129例，女415例，年龄12～82岁，中位年龄为49岁。本研究为回顾性研究，已通过中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的审批（审批号：NCC2019C-018）。所有患者在进行细针穿刺检查前均签署了知情同意书。本研究的基因检测结果并未用于患者的临床管理。

2. 细针穿刺细胞学检查的诊断方法：对超声诊断分级为甲状腺影像报告和数据系统4级及以上的甲状腺结节，采用23G穿刺针（美国Argon医疗器械公司或德国PAJUNK GmbH医疗科技有限公司）进行细针穿刺，每个结节穿1～2针。将穿刺获得的细胞样本涮入盛有30 ml CytoLyt ^®液（美国Hologic公司）的离心管中，振荡、离心后转入保存液小瓶。用ThinPrep ^® 2000制片机（美国Hologic公司）制液基薄片1张，以95%乙醇固定15 min后进行巴氏染色。根据TBSRTC报告系统进行诊断：良性病变为Bethesda Ⅱ级，意义不明确的非典型病变为BethesdaⅢ级，滤泡性肿瘤为Bethesda Ⅳ级，可疑恶性肿瘤为Bethesda Ⅴ级，恶性肿瘤为Bethesda Ⅵ级。

3. 9基因突变检测方法及结果判定标准：利用细胞学诊断的剩余标本，在细针穿刺后的2个月内进行检测。使用DNeasy Blood & Tissue Kits DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取标本中的DNA，使用Multiskan Sky酶标仪（瑞典Thermo Fisher Scientific公司）检测洗脱液中DNA的浓度和纯度。通过多重简并建库平台（北京金则医学检验实验室有限公司），采用NGS技术，在平均测序深度＞500×的条件下，检测样本中BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、TP53、TERT、PIK3CA、GNAS和RET这9个基因中任何癌症体细胞突变目录（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COSMIC）数据库所收录的位点（简称COSMIC位点）的突变状态。9个基因中任意1个基因有COSMIC位点的突变丰度≥5%时，该样本即为9基因突变检测阳性。

4. BRAF V600E单基因检测方法及结果判定标准：以术后组织病理诊断和诊断明确的细胞学诊断结果为金标准，即有术后组织病理诊断结果者以术后组织病理诊断结果为金标准，无术后组织病理诊断结果但细胞学诊断明确（Bethesda Ⅱ级为良性，Bethesda Ⅵ级为恶性）者以细胞学诊断结果为金标准。对于9基因突变检测中BRAF V600E检测阴性的样本和9基因突变检测中BRAF V600E检测阳性但金标准恶性的样本，将9基因突变检测中BRAF V600E检测的结果直接作为BRAF V600E单基因检测结果。对于9基因突变检测中BRAF V600E检测阳性但金标准良性的样本，使用BRAF实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒（北京雅康博生物科技有限公司）复测。如果仍检测到突变者视为BRAF V600E单基因检测阳性，反之，则视为阴性。

5. 术后组织病理学诊断资料收集：579个甲状腺结节中有329个进行了手术切除，从病理诊断系统中查询并记录这些结节的术后组织病理学诊断结果。因为交界性病变的临床管理方式与甲状腺恶性肿瘤一致，均应进行外科手术，因此交界性病变，包括具有乳头样核特征的非浸润性甲状腺滤泡性肿瘤（noninvasive follicular thyroid neoplasm with papillary-like nuclear features，NIFTP） 和恶性潜能未定的肿瘤（uncertain malignant potential，UMP）均视为恶性。

6. 统计学方法：应用SPSS 26.0进行统计分析。计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确率以及受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线的曲线下面积（area under curve，AUC）评价诊断效能。两种诊断方法灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率的比较采用 χ ²检验，AUC比较采用Delong检验。检验水准 α=0.05。

结  果

1. 细胞学诊断结果：依据TBSRTC报告系统，579个甲状腺结节中，196个（33.85%）为Bethesda Ⅱ级，11个（1.90%）为Bethesda Ⅲ级，31个（5.35%）为Bethesda Ⅳ级，27个（4.66%）为Bethesda Ⅴ级，314个（54.23%）为Bethesda Ⅵ级。

2. 术后组织病理诊断结果：手术切除的329个甲状腺结节中，30个（9.12%）为良性病变，包括结节性甲状腺肿和腺瘤样增生25个（7.60%），炎症5个（1.52%）；5个（1.52%）为交界性病变，包括UMP 3个（0.91%），NIFTP 2个（0.61%）；294个（89.36%）结节为恶性病变，包括甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）284个（86.32%），甲状腺滤泡癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）7个（2.13%），经典型PTC合并甲状腺低分化癌1个（0.30%），MTC 1个（0.30%），未具体分类的分化差的癌1个（0.30%）。284个PTC结节中，经典型171个，经典型+滤泡亚型37个，经典型+柱状细胞亚型1个，经典型+实性型1个，滤泡亚型55个，滤泡亚型+柱状细胞亚型1个，嗜酸细胞亚型6个，未分型12个。

3. 基因检测结果：579个甲状腺结节中，9基因突变检测阳性者275个，突变率为47.5%，每个基因的具体突变情况见 表1。9基因突变检测中BRAF V600E检测阳性者有239个甲状腺结节，其中235个金标准恶性，4个金标准良性。这4个金标准良性的结节经实时荧光定量聚合酶链反应复测，3个BRAF V600E突变阴性，1个BRAF V600E突变阳性。最终BRAF V600E单基因检测阳性者为236个结节，突变率为40.76%。

4. 9基因突变在甲状腺恶性病变中的发生率及其恶性风险：在手术切除的329个甲状腺结节中，299个恶性结节9基因的突变率由高到低依次为BRAF 62.21%（186/299）、NRAS 5.02%（15/299）、HRAS 1.00%（3/299）、PIK3CA 0.67%（2/299）、GNAS 0.67%（2/299）、KRAS 0.33%（1/299）、TP53 0.33%（1/299）、TERT 0.33%（1/299）、RET 0.00%（0/299）。各基因COSMIC位点的突变情况见 表2。

在手术切除的329个甲状腺结节中，分别有186、19、4、2、1、1、2和2个结节BRAF、NRAS、HRAS、KRAS、TP53、TERT、PIK3CA和GNAS基因突变阳性，其恶性风险分别为100.00%（186/186）、78.95%（15/19）、75.00%（3/4）、50.00%（1/2）、100.00%（1/1）、100.00%（1/1）、100.00%（2/2）和100.00%（2/2）。BRAF中最常见的突变位点是BRAF V600E，恶性风险为100.00%，NRAS中最常见且恶性风险最高的突变位点是NRAS Q61R，HRAS中恶性风险较高的突变位点是HRAS Q61R，KRAS中恶性风险较高的突变位点是KRAS G12V（ 表3 ）。

5. 9基因突变检测与BRAF V600E单基因检测对诊断不明确的Bethesda Ⅲ～Ⅳ级（诊断不明确）甲状腺病变的诊断效能比较：以术后组织病理诊断为金标准，对有术后组织病理诊断结果的42个Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节进行分析，其中Bethesda Ⅲ级甲状腺结节11个，Bethesda Ⅳ级甲状腺结节31个。42个结节中，术后组织病理诊断为恶性29个，9基因突变检测阳性15个，BRAF V600E单基因检测阳性0个（ 表4 ）。9基因突变检测对Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节中恶性病变的诊断灵敏度为34.48%，特异度为61.54%，准确率为42.86%，阳性预测值为66.67%，阴性预测值为29.63%，而BRAF V600E单基因检测对Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节中恶性病变的诊断灵敏度为0，提示BRAF V600E单基因检测对Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节中的恶性病变病变无检出能力。

6. 9基因突变检测与BRAF V600E单基因检测对Bethesda Ⅱ～Ⅵ级甲状腺病变的诊断效力比较：以术后组织病理诊断和诊断明确的细胞学诊断结果为金标准，即有术后组织病理诊断结果者以术后组织病理诊断结果为金标准，无术后组织病理诊断结果但细胞学诊断明确（Bethesda Ⅱ级为良性，Bethesda Ⅵ级为恶性）者以细胞学诊断结果为金标准。579个Bethesda Ⅱ～Ⅵ级甲状腺结节中，金标准恶性369个，9基因突变检测阳性275个，BRAF V600E单基因检测阳性236个（ 表5 ）。9基因突变检测和BRAF V600E单基因检测对Bethesda Ⅱ～Ⅵ级甲状腺结节中恶性病变诊断的灵敏度、特异度、准确率、阳性预测值和阴性预测值见 表6。两种基因检测方法的特异度和阳性预测值差异有统计学意义（均 P＜0.01），而灵敏度、准确率和阴性预测值差异无统计学意义（均 P＞0.05）。ROC曲线分析显示，9基因突变检测和BRAF V600E单基因检测对Bethesda Ⅱ～Ⅵ级甲状腺结节中恶性病变诊断的AUC分别为0.79和0.82，二者差异无统计学意义（ Z=0.85， P=0.396）。这些结果提示，9基因突变检测和 BRAF V600E单基因检测均可以作为甲状腺细针穿刺细胞学检查的平行诊断方法。

7. 提示不良预后的基因突变：在579个甲状腺结节中，2个诊断为PTC的结节检测到TERT突变，1个诊断为PTC和1个诊断为FTC的结节检测到PIK3CA突变，1个诊断为PTC的结节检测到TP53突变。其中2个检测到TERT突变的结节均伴BRAF V600E突变，其中1例患者术后组织病理诊断证实有2枚淋巴结转移，另1例患者细针穿刺取材于气管周围，为第3次复发灶，提示TERT和BRAFV 600E共突变可能与甲状腺癌的高侵袭性、易复发性等有关。

讨  论

本研究结果显示，在299个术后组织病理诊断为恶性的甲状腺结节中，BRAF V600E突变最为常见，其突变率为61.64%（184/299），而在284个术后组织病理诊断为PTC的结节中，BRAFV600E突变率升高至64.44%（183/284），与OHORI等报道的亚洲PTC人群中BRAF V600E突变水平较高的结论 较为一致，但低于中日友好医院Chen等 报道的76.71%（326/425）和韩国成均馆大学医学院三星医疗中心Choi等 报道的78.8%（67/85，Seeplex检测方法）和84.7%（72/85，Anyplex检测方法）。造成这种差异的可能原因有三：其一，在本研究中，我们为扩大细胞学诊断不明确结节的样本量，有针对性地多收集了一些Bethesda Ⅲ级的标本，其中部分标本细胞量较少，可能会导致BRAF V600E单基因检测假阴性；其二，为提高标本收集效率，切合临床应用，本研究液基细胞学标本的纳入标准中未列入“细胞病理学专家复阅第1张液基涂片，确保病变细胞数＞10片（约100个） ”这一标准，这种做法会导致部分病变细胞纯度过低的标本未被排除，从而使BRAF V600E单基因检测的假阴性率增高；其三，本研究中基因突变检测采用了NGS方法，与第一代测序（Sanger测序）相比，其庞大的数据量导致处理和分析这些数据时的复杂程度显著提高，所以不可避免地会漏诊一些阳性病变。

在本研究有术后组织病理学结果的样本中，BRAF V600E突变的甲状腺结节的恶性风险为100%（184/184），与文献报道 一致，表明BRAF V600E是一个特异度非常高的甲状腺癌诊断标志物，BRAF V600E阳性可作为重要的手术指征之一。TP53、PIK3CA、TERT和GNAS突变甲状腺结节的恶性风险也为100%，但由于突变样本过少，其对临床管理的指导作用还有待进一步验证。NRAS、HRAS和KRAS突变结节的恶性风险分别为78.95%、75.00%和50.00%，与既往的文献报道 相符。因此，RAS突变只是一个对甲状腺结节恶性风险有一定预测作用的检测指标，并不能直接指导相应的临床管理。其中NRAS和HRAS突变提示甲状腺结节具有相对较高的恶性风险，但KRAS的恶性风险则相对较低，因而对外科医师而言，不能仅凭KRAS突变就对甲状腺结节采取手术治疗。本研究中采用的9基因突变检测是参考传统7基因检测（BRAF V600E、HRAS、NRAS、KRAS、RET/PTC1、RET/PTC3和PAX8/PPARG） 设计而成的，因此沿袭了对其中部分基因突变的检测，包括该3种RAS突变。GNAS突变在本研究中显示了很高的恶性风险，且在4个检出GNAS突变的甲状腺结节中，2个经术后组织病理诊断证实为FTC的结节均同时检测出其他基因突变，与本研究团队既往的研究结果 及段焕利 的研究结果一致，表明GNAS突变检测在亚洲人群的甲状腺癌辅助诊断中可能具有一定的意义。本研究中并未检测出RET突变，可能是由于RET突变主要见于MTC，而本研究的样本中仅有1个MTC结节。

细针穿刺细胞学诊断Bethesda Ⅴ级为可疑恶性肿瘤，理论上也属于细胞学诊断不明确，但Bethesda Ⅴ级的恶性风险很高，目前在美国甲状腺学会和美国国立综合癌症网络等指南中被视为一种较为确定的恶性诊断结果，Bethesda Ⅴ级病例的临床管理方式为直接手术，因此，在本研究中只将Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节作为诊断不明确的样本进行分析。对于细针穿刺细胞学诊断为Bethesda Ⅲ～Ⅳ级，即细胞学诊断不明确的甲状腺结节，目前临床上并无有效区分其良恶性的方法，需要借助分子检测为这些患者制定适当的临床管理策略。有研究显示，BRAF V600E单基因检测诊断甲状腺癌的灵敏度在Bethesda Ⅲ级标本中低至16.7%，而在本研究纳入的42个Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节中甚至未检出1个阳性，表明BRAF V600E单基因检测的诊断效能并不理想。有研究表明，甲状腺病变细胞的PTC核特征越明显，则BRAF V600E突变的可能性越高。依据TBSRTC报告系统来看，Bethesda Ⅳ级标本中的细胞无明确PTC核特征，Bethesda Ⅲ级标本中的细胞仅有轻微PTC核特征。此时，9基因突变检测则体现出了明显的优势，可协助判断Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节的恶性风险，但其诊断效能并不很强，灵敏度为34.48%，特异度为61.54%，准确率为42.86%。

在Bethesda Ⅱ～Ⅵ级甲状腺病变中，9基因突变检测与BRAF V600E单基因检测的诊断能力无明显差异，甚至BRAF V600E单基因检测的特异度和阳性预测值略高，作为细针穿刺细胞学的平行诊断方法，BRAF V600E单基因检测有更好的性价比。但9基因突变检测的优势在于加入了可提示甲状腺癌预后的3种基因（TERT、PIK3CA和TP53）突变检测。有研究显示，中位随访24个月，未发生TERT或BRAF V600E突变的PTC患者的复发率为8.7%，仅有BRAF V600E突变患者的复发率轻度升高至25.8%，而发生TERT和BRAF V600E共突变患者的复发率高达68.6%，且无病生存时间比未发生TERT和BRAF V600E共突变及仅发生BRAF V600E突变的患者明显缩短。在本研究中，2个检出TERT突变的甲状腺结节均同时检出了BRAF V600E突变，并且这2例PTC患者均表现出易转移性和易复发性等恶性特征。这些高风险的基因突变可以在甲状腺结节患者的临床管理方面为外科医师提供一定程度的参考。

总之，作为细胞学诊断不明确的甲状腺结节的鉴别诊断方法时，9基因突变检测比BRAF V600E单基因检测有一定优势，但与目前已通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市的Afirma GSC、Thyroseqv3和ThyGeNEXT+ThyraMIRv2等甲状腺癌基因检测平台相比，其诊断效能仍存在差距。不过，这些FDA批准上市的检测平台的检测内容包含了多种基因突变、基因融合和mRNA改变，检测费用普遍较高昂，限制了其应用和推广。因此，对于细胞学诊断不明确的Bethesda Ⅲ～Ⅳ级甲状腺结节，9基因突变检测对于鉴别其良恶性有一定的临床价值。