胸腔积液在肺腺癌基因检测中的应用研究

肺癌最常见的病理类型包括腺癌、鳞癌和小细胞肺癌，其中肺腺癌所占的比例最高，且发病率呈上升趋势。在肺癌的诊断及治疗过程中，持续监测患者基因突变情况对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的靶向治疗具有重要意义。但临床上晚期NSCLC患者不能通过手术获取肿瘤组织，部分患者行活检获取肿瘤组织样本比较困难，而且无论是通过支气管镜对肺部病灶进行穿刺，还是在超声引导下经皮行肺部病灶穿刺，均具有侵入性。气管镜穿刺，除涉及到麻醉用药外，放置气管镜的过程中患者可能有气管收窄、含氧量下降的情况。超声引导下经皮穿刺有可能导致出血和气胸。反复进行入侵性有创的方式采集患者组织样本，实难可取。因此，探索能够安全、无创和可重复获取的检测样本具有重要的临床意义，血液、胸腔积液等液体活检则具有这些优势，并且其样本基因突变的检测也显示出良好的灵敏度和特异度。在本研究中，我们比较了胸腔积液与组织、血浆样本的基因检出情况，对胸腔积液作为NSCLC基因检测的可替代性样本进行了评价，现将结果报告如下。

资料与方法

一、病例选择和样本获取

本研究为回顾性研究，纳入了2015年2月至2019年12月经病理确诊为肺腺癌的患者145例，其中来自北京大学肿瘤医院129例，北京市房山区第一医院16例；男72例，女73例；年龄30~94岁，中位年龄60岁。吸烟者36例，不吸烟者58例，吸烟史不详者51例。

从标本库中共获取145例患者的155例样本，其中胸腔积液55例，血液52例，肿瘤组织48例。130例患者检测1种样本，15例患者检测≥2种样本。本研究经过北京大学肿瘤医院评审委员会批准(审批号：2018KT105)，患者均签署知情同意书。

二、实验方法

1．DNA提取：

胸腔积液10 ml，离心分离出上清。静脉血4~5 ml，离心分离出血浆。使用QIAamp循环核酸试剂盒(美国Qiagen公司)，从胸腔积液上清和血浆中提取循环游离DNA (circulating cell free DNA, cfDNA)。肿瘤组织样本经病理学确认，至少包含≥20%的肿瘤细胞。使用QIAamp DNA迷你试剂盒(美国Qiagen公司)，从肿瘤组织中提取DNA。

2．文库构建：

从肿瘤组织中提取的DNA进行文库构建的主要步骤包括：(1)DNA片段化。(2)文库定量：采用Qubit^® dsDNA HS Assay Kit荧光定量检测试剂盒对片段化纯化产物进行定量，产物浓度应高于2 ng/μl。采用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析仪检测产物的长度分布范围，DNA片段主带在200~250 bp左右。(3)末端修复及加"A"。(4)接头连接。(5)纯化。(6)利用非捕获聚合酶链反应(non-capture-polymerase chain reaction, Non-C-PCR)进行富集。。(7)Non-C-PCR产物纯化。(8)文库质控。从胸腔积液上清和血浆中提取的DNA进行文库构建则省去前两个步骤。

3．下一代测序(next generation sequencing, NGS)：

由北京吉因加科技有限公司完成，NGS检测涵盖了在肿瘤发生发展中常见的1021个肿瘤相关基因。采用SeqCap EZ Library对1021个基因的目标区域进行富集，按照ruSeq PE Cluster Generation Kit v3和TruSeq SBS Kit v3试剂盒说明书的要求对富集文库进行处理后，在Illumina HiSeq 3000测序平台上进行测序。

4．原始数据质控：

即通过NCfilter软件过滤测序过程中的低质量reads(指测序仪单次测序所得到的碱基序列)，收集原始下机数据的质控信息，然后使用realSeq软件对被检测样本中携带的UID(User Identification)信息进行纠错和标记。数据比对：(1)通过BWA软件MEM模块将得到的高质量reads比对到人类基因组，并通过Picard软件的MarkDuplicates模块对白细胞对照样本的PCR重复等人为因素导致的重复reads进行标记。通过realSeq软件对样本中的PCR重复进行基于UID信息的聚簇标记，并通过聚簇情况对测序引入的错误碱基进行纠正和碱基质量值修饰。(2)通过GATK软件的RealignerTargetCreator模块和IndelRealignment模块对重点区域进行重新比对，并通过GATK软件的BaseRecalibrator模块对碱基测序质量值进行重新校正。

三、统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。组间率的比较采用χ²检验或Fisher精确概率法，显著性检验均为双侧检验，检验水准α＝0.05。

结  果

1．在基因检出方面胸腔积液上清比血浆具有更高的敏感性：

与血浆比较，胸腔积液上清的突变检出率更高(P<0.05)，胸腔积液上清和肿瘤组织的最大体细胞等位基因频率(maximum somatic allele frequency, MSAF)和基因拷贝数变异(copy number variations, CNV)更高(均P<0.05)；与肿瘤组织比较，胸腔积液上清的突变检出率、MSAF和CNV差异均无统计学意义(均P>0.05，表1)。可见在基因检出方面，胸腔积液上清比血浆具有更高的敏感性，与肺癌组织相当。

2．胸腔积液上清中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变的检出率更高：

胸腔积液上清EGFR基因突变的检出率为61.82%，高于血浆(P<0.05)，与肿瘤组织差异无统计学意义(P>0.05)。而胸腔积液上清中其他驱动基因BRAF V600E、Erb-B2、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合、ROS1融合、转染重排(rearranged during transfection, RET)融合、间质表皮转化因子(mesenchymal-to-epithelial transition, MET)扩增(含14号外显子跳跃)的检出率，与血浆和肿瘤组织差异均无统计学意义(均P>0.05，表2)。

3．胸腔积液上清和血浆配对样本分析验证胸腔积液上清基因突变检测的优越性：

为验证上述结果，选择同时有胸腔积液上清液和血浆配对样本的患者共5例进行具体分析。5例患者的胸腔积液上清检测到27个突变，其中SNV 21个，CNV 6个；血浆检测到18个突变，其中SNV 18个，CNV无检出(表3)。胸腔积液上清液和血浆所有基因突变检出的一致率为18.52%(5/27)。此结果进一步表明，胸腔积液上清在基因突变的检出上优于血浆，尤其是CNV的检出。

讨  论

随着靶向治疗在肺癌的临床治疗上不断取得进展，分子病理诊断在肺癌临床治疗中的指导作用日益突显。对于不能通过手术或穿刺获取组织标本的肺癌患者，探索其他便捷、可靠的检测样本势在必行，包括血浆、胸腔积液、穿刺细胞学悬液、支气管肺泡灌洗液、痰液和脑转移后脑脊液等。

大部分肺腺癌患者会伴随胸膜腔积液的病理性积聚，即胸腔积液。胸腔积液通过穿刺术就可以获得，提取胸腔积液上清或者沉渣中的DNA，获得包括SNV、小片段插入与删除、融合及CNV等突变信息，可以反映患者的基因图谱特征，在不能获取肿瘤组织时可作为基因检测的潜在替代样本。有研究表明，晚期肺腺癌患者常出现出血性胸腔积液，血细胞在胸腔积液中的存在会干扰肿瘤突变的检测，但与胸腔积液沉渣不同的是，胸腔积液上清提取的cfDNA受非肿瘤细胞成分影响较小，故本研究中采用的是胸腔积液上清这一样本类型。

在基因检测的临床应用中，尤其是对寻找用药机会的肿瘤患者，主要关注基因的单核苷酸突变、CNV及融合检出情况，这些均可作为相关靶向用药的有力证据。在相同测序芯片覆盖及平台条件下，可通过靶向药物相关驱动基因的检出率、染色体水平的CNV检出率等来评价基因检出效力。上海长征医院的一项研究显示，对晚期肺腺癌患者采用血液检测和组织进行基因检测的一致性高达95%，通过比较两种样本的所有基因分类和驱动基因的检出情况，确认了血液基因检测的临床应用价值。本研究结果显示，对于肺腺癌患者，胸腔积液上清在MSAF和CNV检出上与肿瘤组织无明显差异，但高于血浆，提示胸腔积液上清中含有更多肿瘤来源的DNA，可以提供更多的基因突变信息。对EGFR、BRAF V600E、Erb-B2、ALK融合、ROS1融合、RET融合等具体驱动基因，胸腔积液上清EGFR基因突变检出率高于血浆(分别为61.82%和38.46%)，表明从胸腔积液上清中分离出来的cfDNA可以有效提供个体肿瘤的重要基因组信息，当难以获取肿瘤组织时，胸腔积液上清可以作为替代，且优于血浆。

除了肺癌外，胸腔积液还经常出现在晚期乳腺癌、胃肠道癌和卵巢癌中，通过进一步的比较研究有望揭示胸腔积液上清cfDNA在这些癌种中与类似的诊断潜力。另外，不同节点的胸腔积液样本收集，也将提高基因突变检测在临床的广泛应用。

本研究有一定的局限性。(1)样本量较小。(2)本研究中，每例患者的肿瘤组织、血浆、胸腔积液样本并非在同一时间点获取。因此，尚不能客观而完美地揭示不同样本之间突变信息的关系。

总之，基于NGS技术，肺腺癌患者胸腔积液上清与肿瘤组织作为基因突变检测样品的临床意义相当，能提供比血浆样品更全面的突变信息和更高的MSAF，具有较高的可靠性和有效性，可以作为NSCLC基因检测的理想替代样本。

参考文献略。

下载原文：

1. 机构用户IP：中华医学期刊全文数据库（http://www.yiigle.com/）右上角IP登录，正常检索/查看/下载即可

2. 个人帐号：绑定中华医学期刊机构用户后，直接登录本刊官网（http://www.chinjoncol.com/）检索/查看/下载全文（通过万方、中华医学期刊网检索也将跳转至本刊官网）

3. 年卡或单期购买用户：详询中华医学期刊网会员服务

4. 纸质版期刊订阅：中国邮政网上营业厅（https://11185.cn/）检索“中华肿瘤杂志”在出版前订购；或中华医学期刊网-期刊服务-期刊商城订购过刊。