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人们对促进T细胞耗竭的分子和细胞机制进行了30年的基础研究，用于治疗慢性感染和癌症的基于T细胞的疗法成为可能。最近关于T细胞耗竭分化轨迹的研究为免疫治疗提供了新的见解。今天分享一篇2023年9月份发表在SCIENCE IMMUNOLOGY（IF:17.6）的综述文章，该文讨论了发生在T细胞功能障碍路径中的不同发育阶段的标志，以及这些离散的CD8+ T细胞对癌症免疫治疗的影响。
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一、研究背景
在最佳的启动和抗原清除情况下，CD8+ T细胞可建立免疫，为宿主提供终身保护，以应对反复的病原攻击。免疫记忆的形成是由CD8+ T细胞根据病原体的持续时间和致病性进行发育适应所促成的。再次受到攻击时，记忆T细胞相对于原始的naïve祖细胞具有更高的效应细胞功能。这一显著的免疫学特征是目前许多用于控制肿瘤和预防疾病复发的疫苗和T细胞疗法的基础。虽然这些观察结果为在免疫治疗中使用CD8+ T细胞提供了明确的理论基础，但仍需要建立对大多数癌症患者的长期免疫保护作用。限制治疗中T细胞应答持久性的一个明确的障碍是T细胞耗竭的发生。为了更好地理解和克服这一障碍，我们需要明确控制功能性记忆和耗竭T细胞生成的细胞和分子步骤。为了模拟用于治疗的记忆T细胞分化过程，研究集中于定义naïve CD8+ T细胞转变为有效效应细胞和随后转变为长期记忆T细胞所需的步骤。目前已经大量地研究了通过抗原呈递细胞(apc)启动naïve CD8+ T细胞的步骤，随后导致克隆扩增，并为宿主提供大量的细胞溶解效应细胞。值得注意的是，这些效应细胞中的一小部分保留了进一步分化为长期静止记忆T细胞的潜力，这些细胞具有效应基因表达程序，并保持产生稳健记忆反应的态势(图1)。然而，在持续抗原暴露的情况下，效应反应从功能性记忆T细胞分化转向另一种耗竭性发育轨迹。“耗竭”T细胞的产生最初在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)小鼠模型系统中被描述，因为该模型能够直接比较急性和慢性感染应答时产生的抗原特异性T细胞。这些结果表明，慢性刺激的T细胞并不是简单地死亡，而是其增殖和表达效应细胞因子的能力受损。对定义耗竭特征的进一步研究表明，增殖受限与抑制性受体（IR）的表达有关，而抑制性受体会抑制 TCR 信号传导，从而促进免疫检查点阻断（ICB）疗法的发展。该疗法利用阻断抗体破坏IR 与配体的相互作用来增强内源性T细胞反应。此外，只有一部分长期受刺激的 T 细胞对 ICB 有反应，这促使人们努力从转录组学、表型和表观遗传学水平进一步剖析衰竭T细胞池中存在的异质性。最近对T细胞衰竭进展的深入研究指导了T细胞免疫疗法设计的三种模式，以提高免疫保护的效力和持久性：i) 预防T细胞衰竭；ii) 延迟或转移T细胞终端衰竭；iii) 逆转衰竭（图1）。在这篇综述中，作者总结了慢性病毒感染和癌症中调节T细胞衰竭不同发育阶段的细胞和分子机制方面的最新进展。进一步讨论针对癌症中T细胞衰竭的治疗障碍和机会。![]()
图1.一个描述CD8+ T细胞耗竭阶段的进行性模型
当暴露于慢性抗原时，CD8+ T细胞会逐渐减少其效应反应，以平衡免疫保护和免疫病理。这种对T细胞功能的逐步抑制导致了T细胞发育潜能的变化，从能够产生治疗反应到完全不活跃。要使基于T细胞的免疫疗法达到最佳疗效，关键是要确定CD8+ T细胞进入衰竭的时间点。利用克隆13 LCMV 慢性病毒感染小鼠模型对内源性和转移的T细胞进行纵向分析，可以初步了解T细胞在衰竭过程中经历的渐进变化。LCMV特异性CD8+ T细胞表现出渐进式抑制和分级效应多功能丧失，其特点是最初IL-2表达丧失，随后是TNFa，最后是IFNg。此外，从感染后8天的小鼠体内分离出的病毒特异性CD8+ T细胞与后期分离出的CD8+ T细胞相比，保留了更大的记忆潜能。在诱导性小鼠肝脏肿瘤模型中也观察到了这种长期受刺激的T细胞逐渐丧失发育可塑性的现象，来自恶性病变前期和早期的肿瘤特异性CD8+ T细胞在转移到无抗原宿主体内后，能够恢复效应功能并获得记忆表型。这些研究表明，功能记忆与衰竭状态的划分发生在免疫反应的早期，并通过持续的TCR刺激和暴露于免疫抑制组织环境而得到加强。在证明衰竭是一种独立的发育途径后，进一步的工作集中于研究非增殖、终末分化的T细胞如何在初次接触抗原后持续存在数年。随后的研究证实，衰竭的T细胞池是由一种干样祖细胞维持的，这种祖细胞可以自我更新，但在长期接触抗原的过程中也会产生终末分化的T细胞。为了更好地解析衰竭T细胞亚群之间的发育关系，研究发现Tcf1和CXCR5是这种干样祖细胞的标志。这种Tcf1+祖细胞的存在是对ICB疗法产生增殖性爆发的原因，并与多种癌症的治疗效果呈正相关。在小鼠慢性LCMV感染期间，早在感染后第5天就能检测到祖细胞和效应T细胞之间的发育分叉。虽然这个最初的分叉点在概念上类似于急性感染时出现的效应前体和记忆前体的分叉，但这些衰竭的祖T细胞及其后代，包括终末衰竭的T细胞（termTex），都保留了较高的PD-1和转录因子Tox表达量。耗竭的祖T细胞(exhausted progenitor T cells, Tpex)库中存在异质性；相对于 CD62L-亚群，表达CD62L的Tpex被证明是真正的衰竭祖细胞，负责在LCMV感染期间PD-1 阻断后的增殖性爆发。虽然Tpex最初被认为富集了处于功能障碍状态的细胞，但现在Tpex比以前认为的更具多能性。对源自Tpex的各种效应T细胞亚群的评估研究证明了Tpex的内在发展潜力。最近的一项研究考察了CD8+ T细胞在CD4+ T细胞缺失的情况下对慢性LCMV感染的反应，描述了从 Tpex发展出的过渡性Teff样亚群，最终发展到终末衰竭状态（图 1）。一项针对高级别浆液性卵巢癌的研究也提出了类似的线性分化模型（Tpex→Teff-like→termTex）。另外两项独立研究记录了一个类似的效应子集，它富含自然杀伤特征，包括选择性表达杀伤凝集素样受体（KLRs）。在多种人类癌症中，CXCR3+ CD45RA+ 效应记忆（Temra）CD8+ T 细胞群中也富集了这种 Tex-KLR 特征。最近的临床前研究进一步证明了Tpex在适当信号条件下的发育可塑性，研究显示 Tpex 后代在抗 PD-L1 联合 IL-2 激动剂的治疗反应中具有更强的细胞毒性。这些原理性研究也为开发新的联合疗法提供了理论依据，增加对调节衰竭T细胞亚群效应潜能的受体和细胞互作的了解。上文中明确的衰竭发展路径主要源于临床前小鼠模型，T细胞衰竭的进展始于naive状态。然而，人类肿瘤反应性T细胞的发育起点可能并不总是naive状态，重要的是，用于产生采用性细胞疗法（ACT）产物的自体T细胞大多来自记忆性 T 细胞。临床前和临床环境之间的这种生物学脱节促使研究人员提出这样的问题：记忆T细胞在多大程度上对衰竭T细胞池做出了贡献，以及T细胞衰竭的 "记忆-起源 "模型是否可能更为相关。在进行人类ACT研究的同时，对人类肿瘤的研究也发现了多种功能记忆表型，包括内源性T细胞的中心记忆（Tcm）和效应记忆（Tem），这进一步提出了这些细胞是否对肿瘤有反应以及是否会衰竭的问题。对这类肿瘤浸润T细胞的 TCR 测序与转录谱分析相结合，发现了Tcm、Tem 和 Tex 之间共享的 TCR，这表明 Tcm（IL7Rhi）→Tem（Gzmk+）→Tex 是人类癌症终末衰竭的共同轨迹。关于衰竭的其他"记忆起源"研究来自对肿瘤内组织驻留（Trm）记忆 T 细胞的调查。人类肿瘤浸润Trm通常是通过表达CD103和CD69等细胞表面标志物来定义的，而不是与发育阶段相关的特定标志物，这表明Trm可包括祖细胞和效应样衰竭T细胞。虽然在人类癌症中观察到了病毒特异性和与肿瘤无关的Trm，但同时表达组织保留和衰竭表型标记的T细胞可对肿瘤产生反应并预测治疗结果。上述研究强调了终末T细胞衰竭的发展路径，用于定义许多衰竭T细胞亚群的替代标志物是组织归巢或滞留分子。T细胞适应性反应的解剖分区一般始于naive T 细胞通过与APCs相互作用遇到其同源抗原，APCs从外周组织捕获抗原并将其带到淋巴器官的特定区域。在这一启动事件之后，T细胞会下调淋巴归属分子，上调组织浸润受体，从而使其能够被运往抗原来源地，并在那里进行进一步分化。对ICB治疗后肿瘤浸润T细胞来源的评估进一步揭示了不同亚群的解剖分布。这些研究表明，癌症患者体内对PD-1阻断产生反应的T细胞可能来自淋巴组织和血液循环，这就促成了一种理论，即驻留在淋巴组织中的Tpex是一种自我更新的细胞群，可以迁移到肿瘤中并在肿瘤中进行终末分化，从而补充瘤内衰竭的T细胞池。最近一项调查人类头颈部鳞状细胞癌患者CD8+T细胞反应的研究发现，相对于肿瘤，Tpex在淋巴结中富集，并且能够对抗PD-L1产生反应。然而，Tpex的这种ICB反应在转移性淋巴结中被破坏。由此可知，需要一个有别于肿瘤微环境的保护性生态位来保护Tpex，以维持抗肿瘤反应。组织或肿瘤浸润后，T细胞面临着涉及驻留和进一步分化的关键决定。虽然效应样T细胞和终末衰竭T细胞都会获得与抗肿瘤反应正相关的组织驻留程序，但目前还不太清楚Tpex在浸润肿瘤后是会驻留还是会从肿瘤中排出。最近一项追踪体内标记的肿瘤浸润T细胞移动的研究表明，PD-1+Tcf1+CD8+ T细胞可在肿瘤外周和肿瘤排泄淋巴结之间再循环。这种在肿瘤和淋巴结之间转换的能力可能归因于Tpex上淋巴归巢分子的高表达。另一项研究调查了干样肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在人类卵巢癌中的分化轨迹，结果表明，组织驻留是TIL肿瘤反应性的标志，只有肿瘤驻留的干样祖T细胞的存在与疾病预后呈正相关。在慢性LCMV感染小鼠模型中，Ly108+CD69- Tpex亚群被证明具有再循环能力。随着疾病的进展，异源Tpex 中的静止常驻亚群会富集，而迁移亚群则会因慢性疾病后期出现的持续抑制信号而收缩。除了组织浸润后的驻留决定外，CD8+ T细胞在衰竭发展过程中还会经历与每个组织相适应的适应过程。除了在淋巴组织和非淋巴组织之间迁移外，衰竭的CD8+ T细胞亚群还被定位在组织内的特定区域中。研究还发现Tpex在一些人类实体瘤的三级淋巴结构或T细胞-APC 区中富集，这种免疫龛的建立与临床预后的改善相关。据报道，衰竭的 T 细胞并没有在肿瘤内保持惰性，而是通过分泌 CCL3/4/5 积极招募单核细胞进入肿瘤微环境，随后促进单核细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），TAM 可为 T 细胞提供能量并进一步促进衰竭。总之，这些结果详细说明了衰竭的T细胞亚群与其他免疫细胞在终末衰竭的发展过程中的相互作用（图 2）。![]()
图2.Tex亚群的解剖学划分
CD8+T细胞衰竭产生的空间和时间阶段，通过一系列细胞接触，结合了来自TCR、共刺激和细胞因子的信号。这些信号中的每一个信号是如何促进祖细胞和终末衰竭T细胞之间的发育转变的，这为我们深入了解T细胞亚群之间的关系以及支配它们在不同阶段之间转变的下游信号提供了重要的视角。在这些信号中，TCR信号对衰竭的发展至关重要。虽然研究表明Tpex 的维持与抗原无关，但长期TCR参与对Tpex自我更新能力的影响仍有待全面阐明。从小鼠病毒和肿瘤模型系统中分离出的表型定义的衰竭亚群的转录谱分析显示，Teff样和终末衰竭的T细胞富含TCR信号特征，而这种特征在Tpex中并不明显，这就提出了关于不同亚群所经历的TCR信号强度的问题。虽然 P14 CD8+ T细胞最初经历了TCR信号的快速诱导，但在PD-1结扎后，TCR信号随之受到抑制，而PD-1阻断抗体可成功缓解这种抑制。结果表明，虽然T细胞的同源抗原可能存在于慢性感染或癌症的整个过程中，但衰竭T细胞池所经历的TCR信号强度却各不相同。对单个亚群的 TCR 信号强度的评估表明，TCR刺激在慢性抗原暴露期间维持Tpex的潜在作用。TCR刺激的强度取决于TCR与同源肽-MHC之间的结合活性。在急性抗原挑战下，TCR-肽-MHC 亲和力对T细胞活化和分化动力学的影响已被广泛研究，但在慢性疾病环境中仍有待研究。在小鼠肺癌和纤维肉瘤模型中，亲和力改变的TCR和改变的肽配体分别被用来调整 TCR-pMHC的亲和力，亲和力较低的TCR促进了干样表型（PD-1+Tcf1+），而亲和力较高的 TCR 则促进了肿瘤的终末衰竭。已有研究表明，在慢性感染过程中，高抗原水平会促进CD8+ T细胞的衰竭表型；然而，多项研究对这一概括提出了进一步的改进。例如，在 TCR 刺激不理想的情况下，PD-1 阻断可促进 T 细胞终末衰竭。未来对 TCR 信号强度在 T 细胞衰竭的不同发育阶段的作用以及这些分化阶段发生的解剖部位的研究，能让我们更好地了解其对衰竭 T 细胞系规范和维持的影响。许多有关TCR信号转导和细胞动态的研究都依赖于克隆TCR转基因。使用具有单一TCR特异性的工程 T 细胞表明，所观察到的群体动态不能用TCR复合物之间的异质性来解释，并强调了共刺激和细胞因子信号转导的重要性。虽然共刺激受体在 T 细胞启动过程中的作用已得到深入研究，但它们在衰竭发展过程中的亚群分化功能还不完全清楚。协同刺激配体-受体对包括多种成员，其中包括特征明显的 CD28 和肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。新出现的证据描述了 CD28 和 ICOS 在 CXCR5+Tcf1+ CD8+ T 细胞中的富集，这促使人们进一步研究共刺激受体在不同衰竭状态之间的转换中所起的作用，以及这些受体对 CD8+ T 细胞对PD-1阻断反应的影响。根据对ICB反应人群产生于分化程度较低状态的观察，CD28可能是促进 Tpex 最终分化以产生 Teff 样细胞和/或扩增 Teff 样亚群的关键，这一点最近已在肿瘤环境中得到证实。ICB 和共刺激受体联合治疗后，TILs 的表型和功能评估进一步揭示了共刺激受体对 CD8+ T 细胞衰竭的调控作用。OX40在促进Tpex分化为末端Tex方面可能起着类似于CD28的作用。这些共刺激受体并不局限于CD8+ T细胞，它们中的许多在Treg激活中也发挥着关键作用。虽然持续的TCR刺激足以诱导体外的功能衰竭，但体内衰竭T细胞的产生还涉及来自共抑制途径的额外信号，这些信号可促成不同表型的产生。多种IRs的持续表达是主要的适应策略之一，其作用是在慢性抗原暴露过程中平衡TCR和共刺激信号并防止活化诱导的细胞死亡。然而，急性活化的T细胞在形成记忆之前也会短暂上调IR，慢性疾病中的IR表达可与T细胞功能障碍脱钩。在这些IRs中，PD-1在T细胞衰竭发展过程中的作用已经得到了很好的描述。PD-1介导的T细胞效应潜能抑制最初是在接受 PD-L1 阻断抗体治疗的慢性感染小鼠中描述的，而随后的研究从基因上破坏了 CD8+ T 细胞中编码PD-1的基因。这导致在慢性抗原反应的效应阶段克隆扩增增强，表明 PD-1 在限制早期末端效应 T 细胞发育的同时也使 T 细胞向衰竭系倾斜。PD-1 阻断后，Tpex亚群的增殖和效应反应更强，这表明PD-1信号阻止了Tpex的末端分化。相对于termTex，Tpex中也富集了其他IRs，包括 CD83、CD160、CD200r1、CD200r2和Lag3，这意味着这些受体在调节Tpex的发育和维持中的作用尚未明确。除了来自抗原和共调受体的信号输入外，CD8+ T 细胞还通过副分泌和自分泌细胞因子对环境做出反应，从而扩大或抑制反应。IL-2最初被描述为一种T细胞生长因子，现在已被广泛认为是许多免疫细胞用来支持其生存的细胞因子。IL-2与TCR刺激相结合，具有极强的扩增T细胞的能力。IL-2与抗-PD-1联合使用，可协同增强T细胞效应潜能，从而改善病毒控制。对产生这种协同效应的衰竭T细胞亚群进行仔细研究后发现，Tpex表达高水平的CD25，被认为是主要的IL-2 反应亚群。在慢性抗原暴露期间，TCR和IL-2信号在驱动Tpex衍生的Teff 样T细胞分化和扩增以充分发挥其潜能方面具有共同依赖性。鉴于IL-15信号支持记忆T细胞的生成和维持，IL-15现已成为增强CAR-T细胞干性的一个重要靶点。在小鼠系统中，IL-15与抗PD-1联用可增强抗肿瘤疗效，同时限制全身毒性。与上述促炎细胞因子的作用相抵消，抗炎细胞因子也在T细胞衰竭的发展过程中发挥作用。IL-10可抑制抗病毒T细胞反应并延长感染时间。在肿瘤环境中也观察到了IL-10的这种免疫抑制作用。IL-10并不能完全被描述为一种抑制性细胞因子，我们有必要进一步研究它在 T 细胞衰竭过程中发挥的亚群特异性调节作用。TGFb曾被描述为慢性感染和肿瘤发生过程中的免疫抑制细胞因子，现在人们认识到TGFb对T细胞分化的影响是阶段性的。最近的研究重新审视了TGFb信号在新定义的衰竭亚群中的作用，发现其在通过淋巴组织保留和作为 mTOR活性调节剂保存Tpex方面具有关键作用。这些发现共同强调了通过IRs和细胞因子发出的抑制信号在维持衰竭的祖细胞和提供针对慢性抗原的长期保护方面的重要性。T细胞新获得的表型和功能的遗传性维持促使人们研究基因调控的内在变化是否是适应性T细胞反应长效性的基础。对急性和慢性抗原暴露环境中的T细胞进行转录谱分析后发现，幼稚T细胞、效应T细胞、记忆T细胞和衰竭T细胞表达了截然不同的基因表达特征，这些特征与每个T细胞亚群的特定功能相关。作者总结了在衰竭 T 细胞发育过程中起关键作用的 TFs的作用（表 1），最近的几项发现在衰竭T细胞亚群之间转换过程中发生转录变化。记忆T细胞和衰竭T细胞在形成过程中会发生高度动态的转录重编程，这就需要一种机制来稳定新获得的细胞程序和功能。传统上用于定义辅助细胞亚群的基因位点的染色质可及性之间存在关联。研究表明，虽然 CD8+ T 细胞在急性感染期间保持着表观遗传可塑性，但这些程序在慢性感染期间得到了强化。表观遗传修饰不仅是发育轨迹上各种转录状态的相关因素，现在还被认为是已衰竭T细胞命运的决定因素。表观遗传学程序加强了ICB反应性Tpex群体与ICB非反应性末端群体之间的过渡。DNA甲基化的其他介质也被发现限制了T细胞的功能。研究证明了DNA甲基化在强化T细胞衰竭中的重要性，并说明了表观遗传重编程限制T细胞功能障碍的治疗潜力，进一步研究其他表观遗传调节因子在慢性疾病环境中对CD8+ T细胞分化的作用（图 3）。综上所述，组蛋白和DNA表观遗传修饰加强了Tex亚群之间的发育转变，深入了解这些机制可以提高各种免疫治疗策略的疗效。肿瘤特异性T细胞是通过使用自体肿瘤细胞或裂解物培养TILs来鉴定，目的是分离扩增的T细胞群。在肿瘤相关抗原(TAA)和新抗原已经确定的情况下，可以通过特异性肽刺激或基于HLA多聚体的细胞分选来选择肿瘤反应性T细胞。然而，MHC上呈递的肿瘤抗原的低亲和力和密度，以及耗竭的肿瘤反应性T细胞对肽刺激的应答能力低下，这些往往限制了这些方法的敏感性。作为体外扩增方法的替代方法，其他研究者依赖于T细胞耗竭特征的富集，作为识别肿瘤特异性克隆扩增的替代方法。对TILs在人类转移性癌症中的肿瘤特异性的深入研究表明，大多数新抗原特异性T细胞获得了耗竭的T细胞程序，包括Tox, CXCL13, CXCR6和IRs的富集，而病毒特异性TCR克隆主要在Tem和Trm人群中发现。纵向表观遗传学分析进一步证实，CD19 CAR T细胞作为T细胞耗竭的因果调节因子逐渐富集。利用我们对细胞和分子机制的理解，调节耗竭发生的不同方法正在研究中，目的是通过保留细胞可塑性来增强CAR T细胞抗肿瘤应答。在难治性肿瘤或再激发条件下，CAR T细胞仍具有增殖和产生持续抗肿瘤应答的能力。同样，使用低甲基化药物地西他滨治疗CAR T细胞可改善抗肿瘤和增殖功能，并降低耗竭相关基因表达。虽然目前增强T细胞抗肿瘤功能的方法似乎不是恶性肿瘤的驱动因素，但使用这些策略治疗难治性疾病应谨慎进行。调节转录因子活性也代表了增强CAR T细胞功能的可行方法。过表达c-Jun的CAR T细胞表现出更强的扩增能力和效应潜能，同时较少的终末分化，这在多个临床前肿瘤模型中导致了更好的肿瘤控制。总之，这些研究表明，更好地理解T细胞耗竭的发育阶段和控制这一分化过程的分子机制，可以识别阻碍T细胞疗法转化为癌症和慢性病毒感染的细胞和分子障碍。对耗竭T细胞谱系特异性的理解为CD8+ T细胞如何适应病毒和肿瘤抗原的慢性暴露提供了更详细的观点。这篇综述将这些见解转化为治疗方法。随着T细胞耗竭的各个阶段越来越清晰，由机制驱动的改善T细胞免疫疗法的方法现在包括预防、延迟或逆转向终末状态的发育转变。解决这些问题可能有助于引入下一代基于T细胞的疗法，并扩大我们对慢性疾病中T细胞功能障碍的理解。参考文献
Lan, Xin et al. “Cellular and molecular waypoints along the path of T cell exhaustion.” Science immunology vol. 8,87 (2023): eadg3868. doi:10.1126/sciimmunol.adg3868
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