脑转移（BM）是最常见的颅内恶性肿瘤，死亡率极高，而肺癌是BM最常见的来源。然而，肺腺癌（LUAD）引起BM的细胞起源和驱动因素尚未明确。今天给大家分享一篇今年1月发表在Neuro-Oncology(IF=15.9)杂志上的一篇基于单细胞以及bulk数据揭示肺腺癌脑转移细胞起源和驱动因素的研究。
研究背景
脑转移（BM）是最常见的颅内恶性肿瘤，约30%的实体瘤会发生颅内转移，其中肺癌的发生率最高。肺癌BM患者的预后很差，并且治疗手段有限，只有手术切除、放射治疗和针对原发肿瘤的系统治疗。然而这些治疗方法并不令人满意，因此早期识别BM高危患者尤为重要。
目前已经有许多关于预测肺癌BM的研究，主要集中在临床因素或分子生物标志物，但尚未找到理想的预测因子。近年来，随着免疫疗法和肿瘤免疫微环境研究的普及，学者们也开始关注微环境中的细胞与肿瘤细胞相互作用的影响。然而，相关研究仍处于临床前阶段。
本研究聚焦于肺腺癌的BM。通过分析PT和BM样本的单细胞转录组数据，鉴定了免疫细胞分布的差异以及恶性上皮细胞的一个亚群也就是BM相关上皮细胞（BMAECs）。在临床应用方面，基于BMAEC丰度建立了BM指数，还鉴定了一个BMAECs的marker基因S100A9。我们的研究为患有BM高风险的LUAD患者早期检测奠定了基础，并为进一步研究BM的免疫微环境提供了启发。
数据信息
发现集数据来源于GSE131907数据集，选取其中的11个PT和10个BM样本。bulk RNA数据使用了TCGA-LUAD队列，另外从TCPA数据下载了TCGA-LUAD队列的蛋白组学数据。此外，作者收集了在北京协和医院作过手术切除并且通过病理诊断的LUAD患者样本。10个患者分别取了PT和BM组织，20个患者取了PT组织，33个NMPT（无转移性原发肿瘤）患者取了PT组织，共63例PT样本。另外27个患者取了BM组织，共37例BM样本，包含15例早期BM（PBM）、2例同步性BM（SBM）和20例异时性BM（MBM）。
主要结果
单细胞转录组揭示了肺腺癌PT和BM样本中的细胞组成和免疫微环境
单细胞数据进行质量控制、数据归一化和主成分分析后，分成了23个细胞簇，基于已知marker对细胞簇进行注释（图1BC）。PT和BM样本中免疫细胞占比均是最高的，分别是86.9%和60.3%；尤其是T细胞，在PT样本中占了将近一半（48.7%），在BM样本中比例是19.3%。然而与PT不同的是，BM中最丰富的细胞是上皮细胞（33.1%），其次是T细胞（19.3%）和巨噬细胞（17.6%）。LUAD原发性和转移性样本的细胞占比存在显著的差异（p<0.001，图1F）。
图1 单细胞分析确定PT和BM样本中不同的细胞组成
为了进一步阐明这些细胞谱系的详细细胞组成和亚群及其在促进LUAD脑转移中的作用，进行了免疫细胞和神经胶质细胞亚群分析。
7083个巨噬细胞鉴定了10个簇，分为4个亚群（图2AB）。M1巨噬细胞在PT（86.7%）和BM（54.9%）样本中最丰度，而免疫抑制M2巨噬细胞在BM（32.4%）中比PT（0.4%）中丰富（p<0.001，图2C）。GSVA分析表明，缺氧、mTORC1信号通路、P53信号通路和DNA修复通路在BM巨噬细胞中被显著激活，而干扰素-γ反应、炎症反应和TGF-β信号通路在PT巨噬细胞中被激活（图2D）。使用PUMCH队列的30个LUAD原发样本和37个BM样本进行CD163和CD68免疫荧光共定位染色，结果显示BM中M2巨噬细胞的丰度显著高于PT样本（p=0.032，补充图3AD）。
此外，19736个T细胞划分了17个簇，分为9个亚群（图2EF）。PT和BM样本的亚群占比存在显著差异（p<0.001），CD4+T细胞在PT和BM样本中均是占比最高的（图2G）。GSVA分析显示，KRAS信号通路在BM的T细胞中被激活，而G2/M检查点、TGF-β信号通路和Wnt/β连环蛋白信号通路在PT的T细胞中被激活。在PT和BM样本中进行CD4和CD8免疫组化，结果如补充图3BC所示，定量评分结果表明PT样本中CD8表达高于BM样本（p=8.1e-4，补充图3E）。另外PT和BM样本中，CD4的表达水平均显著高于CD8（补充图3F）。
图2 巨噬细胞和T细胞的亚群注释
补充图3 IF共定位染色图
CNV和克隆亚型分析揭示BM肿瘤的细胞起源
利用inferCNV算法分析PT和BM样本中恶性细胞的克隆结构和细胞起源。PT样本中共2346个上皮细胞，其中1517个CNV评分高的认为是恶性的（图3C）。考虑到脑组织中没有固定的上皮细胞定居，BM样本中的5547个上皮细胞都认为是恶性的，尽管有很少一部分CNV评分较低的细胞。然后使用系统发育树来展示PT和BM恶性细胞的肿瘤克隆和进化。在PT样本的所有恶性上皮细胞中均发生了1q的扩增，只有42%的细胞发生了7p和7q的扩增（图3E）。有趣的是，在BM样本中所有恶性细胞都发生了7p和7q的扩增，77.7%的亚克隆发生了1q的扩增（图3F）。Upset图显示，PT样本中发生了7p和7q扩增的6个亚克隆型在7号染色体上CNV区域相关基因的交集是36个（图3G）。BM样本中发生了7p和7q扩增的所有亚克隆型在7号染色体上CNV区域相关基因的交集是100个（图3H）。Venn图表明，当LUAD肿瘤转移到大脑时，保留了7号染色体上35个基因的扩增，BM样本还发生了65个基因的扩增（图3I）。这些发现表明，BM中的上皮细胞可能来自于发生了7号染色体插入的PT亚克隆型，转移到大脑的恶性细胞在进展和转移过程中也产生了更多新的CNV克隆亚型。
图3 PT和BM上皮细胞的CNV以及亚克隆分析
为了进一步评估PT和BM样本的肿瘤内异质性，我们使用了一种新方法，根据恶性细胞转录组计算每个样本的多样性得分。PT样本的多样性得分显著高于BM样本（p=0.015，图3J），而PT中恶性细胞的细胞占比显著低于BM（p<0.001，图3K）。一般来说，BM样本相对于PT样本具有更低的瘤内异质性和更高的肿瘤纯度。GSVA分析结果表明，MYC靶向、PI3K/AKT/MTOR信号通路、上皮-间充质转化和细胞代谢相关途径在BM恶性上皮细胞中显著激活（图3L）。
拟时序分析识别BM相关的EC亚群
为了进一步阐明上皮细胞的细胞亚群及其在BM中的作用，将来自PT和BM样本的7064个恶性上皮细胞分成11个亚群（图4A），命名为EC0-10（图4B）。基于伪时间排序进行轨迹分析，将恶性上皮细胞投射到不同的分支上。PT和BM样本的恶性上皮细胞基本上遵循相似的分化轨迹，参与7种细胞状态的转变过程（图4C）。11个亚群中只有亚群2同时包含PT和BM样本的共900个细胞，所以接下来对亚群2的细胞单独进行拟时序分析，得到了3种细胞状态，包含1个根和2个分支（图4D）。S3的细胞主要来源于PT样本，S2的细胞主要来源于BM样本，而S1的细胞来源于PT和BM样本（图4E）。GSVA分析表明，3种细胞状态具有不同的活跃的分子通路（图4F）。例如，在S1和S2状态下，上皮-间质转化被显著激活，这表明上皮-间质转化可能在促进祖细胞分化和发育为BM相关细胞亚群种发挥关键作用。
随后，进行分支表达式分析建模（BEAM）来确定三种状态的分支依赖基因。识别了45个基因，这些基因可以调节细胞从S1（分支前）到S2（细胞命运1）以及S1到S3（细胞命运2）的分化过程（图4G）。由于EC2亚群中的肿瘤细胞经历了从祖细胞到两种不同细胞命运的可逆转换，作者认为这种可塑性可能揭示了BM的驱动机制。因此，将EC2亚群定义为BMAECs。GSVA分析结果表明，与原发灶的其他恶性细胞相比，大多数致癌标志通路在BMAECs中显著激活，这可能揭示了BMAECs大脑转移潜能的潜在机制。
图4 脑转移相关特定亚群的识别
PUMCH队列验证BMAECs与转移和预后的关联
作者先鉴定了EC以及EC2的特征基因，两者的交集认为是BMAECs的特征基因（31个）。将这31个特征基因与45个分支依赖基因交集的6个基因定义为BMAECs代表性基因（图5A）。最后，在综合了蛋白的功能以及初步实验后，作者选择了S100A9作为BMAECs的标记基因。5种标志物的多重IF有效区分了PT和BM中的S100A9+EPCAM+恶性细胞和S100A9+炎症细胞（图5B）。为了验证BMAECs在BM中的重要性，我们对30个LUAD PT样本、37个BM样本和33个NMPT（无转移性原发肿瘤）样本中的BMAECs（S100A9）和EC（EPCAM）细胞标志物进行免疫荧光共定位（补充图5）。与没有发生BM的NMPT患者相比，在发生BM患者的PT样本和BM样本中，S100A9和EPCAM都表达的BMAEC细胞比例显著更高（图5C），然而PT和BM样本、MBM样本以及PBM样本之间的BMAEC比例没有显著差异（图5CD）。ROC分析结果表明，BMAEC比例（脑转移相关上皮细胞的比例定义为脑转移相关上皮细胞/恶性上皮细胞）在区分发生BM的肺腺癌PT样本与没有发生BM的肺腺癌PT样本方面表现出色（图5E），AUC为0.806，灵敏度为70.0%，特异性为78.8%（图5F）。根据最佳临界值，BMAEC比例大于3.803%（定义为高BMAEC比例）的LUAD患者被认为具有更高的BM风险。KM生存分析结果表明，高BMAEC比例的LUAD患者的无转移生存率明显较差（图5G）。然而高、低BMAEC比例的患者间OS无显著差异（图5H）。总之，这些发现表明，在未来有脑转移的肺腺癌原发样本中，BMAEC的丰度明显更高，并且BMAEC的比例越高，患者就越早发生脑转移。
图5 PUMCH队列验证BMAECs与转移和预后的关联
补充图5 IF染色和H&E图
TCGA-LUAD队列中BM指数与临床病理特征的关联
通过应用逻辑回归算法，基于TCGA-LUAD患者的RNA-seq数据计算了BM指数，用来表示患者BMAECs的相对丰度（图6A）。TNM I期到IV期，BM指数显著升高，但是T1期显著低于T2-4期（P=0.015），N0期显著低于N1-3期（P=4.4e-7，补充图6A）。单变量和随后的多变量cox回归分析表明，在TCGA-LUAD队列中，BM指数是OS和DFS的独立预后因子（补充图6B-E）。KM生存分析表明，BM指数高的患者表现出明显较差的OS（图6B）和DFS（图6C）。这些发现表明，BMAECs丰度较高的LUAD患者TNM分期较高，预后较差。
图6 识别对BMAECs以及高BM指数患者具有高敏感性的治疗药物
识别高BM指数患者的BMAECs治疗药物
作者使用了两种方法来确定可以抑制LUAD脑转移的候选药物，包括针对BMAECs和高BM指数患者的高敏感性药物（图6D）。作者获得了靶向BMAECs的78种CTRP衍生化合物和65种PRISM衍生化合物，以及用于高BM指数患者的23种CTRP衍生化合物和171种PRISM衍生化合物。通过取交集，最终确定了2种CTRP衍生化合物（lapatinib和zebularine）和5种PRISM衍生化合物（LGX818，repsox，RG2833，simvastatin，tosedostat）作为治疗脑转移的候选药物，其在BMEAC和高BM指数患者中具有较低的AUC，并且与BM指数呈负相关（图6E和补充图7）。拉帕替尼被推荐用于研究其对LUAD脑转移的抑制作用。从两方面考虑，一是拉帕替尼药物靶点的mRNA水平，与MECs相比，靶点EGFR、ERBB2和RIPK2在BMAECs中高表达（图6F右，这里是根据相关性系数的绝对值大于0.3筛选的），并与AUC呈负相关（图6F左）。同样，ERBB3、PIK3C2B、EGFR和ERBB2在高BM指数患者中高表达，并与AUC呈负相关（图6G）。二是药物靶点的蛋白水平，EGFR和EGFR-pY1068在高BM指数患者中高表达，并与AUC呈负相关（图6H）。因此，EGFR被确定为拉帕替尼治疗LUAD脑转移的潜在靶点。需要进一步的研究来验证这些药物通过靶向BMAECs和具有高BM指数的患者来治疗LUAD脑转移的治疗价值。
文章总结
在这项研究中，分析了单细胞数据用来表征LUAD BM的免疫微环境。还鉴定了一个可能代表BM细胞起源的细胞亚群BMAECs及其潜在的生物标志物S100A9。然后，作者使用配对样本验证了这些结果。这些发现为我们提供了在未来能更准确地早期识别BM高危患者的可能性。此外，作者还预测了针对BM高危患者的有效治疗药物，为未来进一步的临床研究奠定了基础。文章在数据上整合了组织及单细胞测序数据，在方法上“干湿结合”，内容充实，有理有据，令人信服，十分值得我们参考学习。
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