导读：狼疮肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）的慢性并发症。目前，几乎没有药物能够在不引起严重副作用的情况下延缓LN的进展。因此，迫切需要进一步研究LN的发病机制，以确定新的治疗靶点，并帮助开发治疗此类疾病的新方法。在该研究中，研究者使用GEO和TRRUST数据库进行靶点筛选，发现阴阳蛋白1号（Yin Yang 1, YY1）可作为LN的潜在治疗靶点。而后对YY1配体进行筛选，发现了rebamipide可作为YY1拮抗剂并用于治疗LN。进一步地，研究者在LN小鼠模型中，发现rebamipide可调节淋巴细胞活性、减少自身抗体产生，并限制免疫复合物沉积、抑制巨噬细胞活化等。这些数据表明rebamipide可能对免疫细胞功能有重要的调节作用，并可能改善患者LN发展。本研究为进一步探索LN的发病机制和治疗手段提供了坚实的基础。
大家好！今天分享的文献是2024年11月26日发表于Pharmacological Research上（IF=9.1，药理学SCI顶刊、JCR Q1）的一篇药理学佳作，该研究通过数据库筛选，发现了一种蛋白阴阳1号（Yin Yang 1, YY1）可作为狼疮肾炎（LN）的潜在治疗靶点，并筛选了一种有效缓解疾病的YY1拮抗剂，无论是对于疾病机制的理解，还是药物临床应用的推广，都是很有价值的，具体内容请听进一步分解：
当我们看到这样一篇研究时，是否会好奇，“阴阳蛋白YY1”是个什么东西？和中国传统文化中的“五行”、“太极”有什么关系吗？实际上，YY1之所以有这样的名字，是因为在研究该蛋白质功能之初，哈佛大学施扬教授发现其作为一种转录因子，在不同情况下（如是否依赖于Polycomb家族蛋白），时而能发挥转录激活作用，时而又能发挥转录抑制作用，这像极了“阴阳太极”，似乎“阴”和“阳”的辩证统一在这小小的蛋白质中得到了具象的体现，因此将其命名为“阴阳蛋白”，其英文名“Yin Yang 1”也是用中文拼音而非英文单词来命名的，颇有一种中国传统文化的美感。
说回到这篇文章，系统性红斑狼疮（SLE）是一种较为常见的自身免疫性疾病，其发病机制复杂、临床表现多样，SLE患者的免疫系统往往存在过度活化，引发促炎细胞因子风暴以及大量免疫复合物在肾脏沉积，进一步导致LN发病，对患者的生活质量造成极大影响，且死亡率也不容小觑。然而，目前还没有可靠的临床方法能在不带来严重副作用风险的前提下有效延缓LN的疾病进展，因此对于LN的发病机制研究和治疗药物开发显得非常重要，这就有了本文数据库筛选+湿实验验证+药理学阻断，“三位一体”的高质量药理学研究了。
图1：该论文的研究框架
研究者首先利用GEO数据库筛选与LN相关的靶点，选取了GSE112943数据集，该数据集是一组micro-array测序数据，测序平台为GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip。该数据集收录的样本数为47，其中包含了14例LN患者和7例健康对照的肾脏组织样本。研究者使用GEO数据库关联的便捷分析平台GEO2R进行差异基因表达谱的分析，筛选那些Log2Fc > 2且P < 0.05的差异表达基因（DEGs），并对这些DEGs进行KEGG和GO生物富集分析，以考察它们富集在哪些信号通路、生物过程上。结果发现这些DEGs似乎与TNF、I型干扰素、IL-1应答等密切相关。
我们知道，基于高通量测序的靶基因筛选会拿到海量的分析结果，但哪些基因是值得验证的呢？该挑什么信号通路入手呢？根据所选基因不同，验证表型时所取得结果可能会差之千里。值得学习的是，本文的研究者引入了第二个数据库TRRUST，该数据库全名是“Transcriptional Regulatory Relationships Unraveled by Sentence-based Text mining”，也就是基于文本数据挖掘筛选某些基因之间的互作以及转录调控关系。研究者在DEGs中筛选出那些在LN患者肾脏中显著上调的基因，将其分别导入TRRUST数据库进行检索，发现其中很大一部分DEGs都受到YY1的调控。这在GSEA富集分析中也得到验证。也就是说，YY1很有可能介导了LN的发生与发展。尽管该方法还筛选到一些其他候选基因（如SP1、SPL1等），但研究者还是选择了YY1这一与免疫、炎症和肾脏疾病密切相关的基因开展下一步研究。
图2：YY1可能与LN的发病机制密切相关
研究者假设YY1与LN发病相关，因此首先比较了在LN患者和LN小鼠模型（即MRL/lpr小鼠，可自发形成SLE等自身免疫病）中YY1的表达。免疫荧光染色结果显示，相较于对照组肾脏，无论是LN患者还是LN小鼠模型的肾脏中都出现了YY1的表达上调，在脾脏中也是如此。
进一步对LN和对照肾脏进行转录组测序，并对DEGs进行生物富集分析，发现这些DEGs显著富集在抗原加工与提呈、淋巴细胞活化、IL-17产生等生物过程中，这些都对LN的发展至关重要，将为该研究下面的机制探索提供思路。
图3：YY1在LN肾脏中表达上调
说明YY1与LN相关后，进一步考虑YY1功能本身是否和LN发病存在因果关系。研究者通过AAV载体在MRL/lpr小鼠体内过表达或敲除YY1，首先发现敲除YY1后小鼠的脾脏体积减小，而过表达时则脾脏体积明显增大。此外，敲除YY1可显著降低小鼠尿蛋白、血清肌酐和血尿氮素水平，这些都是肾功能相关的指标，而过表达之后这些病理性指标显著升高。对促炎细胞因子的Elisa检测也得到了相同的结果。在组织层面，敲除YY1可显著改善一些由LN引起的组织病理学特征，同时减少免疫复合物沉积、降低产生促炎细胞因子的水平。
图4：敲除YY1可缓解小鼠LN
研究者进一步通过高通量药物筛选的方法寻找YY1拮抗剂或激动剂，通过表面等离子共振（SPR）法结合分子对接考察YY1与所筛选小分子间的互作关系，以小分子与YY1的对接分数和解离常数为指标进行排序，结果发现一种小分子药物rebamipide能与YY1的N369、Y383、S397等氨基酸残基形成氢键并稳定结合，初步的体外模型验证也发现rebamipide能够以剂量依赖的方式抑制293T-oeYY1细胞系和原代M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子IL6、IL1β和TNFα，这在肾实质细胞上也得到验证。研究者为了模拟真实LN环境中的免疫细胞环境，在体外将巨噬细胞与肾实质细胞共培养，并发现在共培养条件下rebamipide同样能够抑制促炎细胞因子分泌。这些结果均显示通过高通量药物筛选得到的rebamipide能拮抗YY1并发挥抗炎作用。
接着，研究顺理成章地过度到小鼠模型上，研究者假设rebamipide同样能够缓解小鼠LN。所使用的检测手段与上述第4部分大同小异，且实验结果也都是符合预期的，即rebamipide可显著影响免疫细胞功能并缓解小鼠LN，此处就不再赘述了。
图5：筛选rebamipide作为YY1拮抗剂，并验证其抗炎作用
接着探讨rebamipide改善LN的机制。老生常谈的是，我们仍旧需要一个表型与机制之间的桥梁。研究者使用了转录组测序比较rebamipide治疗前后LN小鼠肾脏的差异基因表达谱，并进行了生物富集分析，发现rebamipide可能抑制淋巴细胞活化、IL17产生、免疫球蛋白复合物和自身抗体产生、巨噬细胞激活等。研究者进而对这些结果进行验证，取LN小鼠的脾脏分析免疫细胞表型（这里为什么取脾脏而不取肾脏？因为肾脏是靶器官、是LN受累的位置；而脾脏是适应性免疫的“军火库”，大量的T、B淋巴细胞在这里聚集，便于我们研究免疫细胞表型）。符合预期的是，rebamipide处理可逆转由LN导致的免疫细胞表型变化，包括Th分化等。进一步对肾脏进行免疫荧光检测，所检测的指标是CD3（泛T细胞）、CD4（Th细胞）、IL17（Th17细胞）、CD19（B细胞）、CD138（浆细胞）和CD86（M1巨噬细胞），类似地，rebamipide可调节这些免疫细胞在LN小鼠肾脏中的比例。
图6：Rebamipide可调节免疫细胞表型并改善LN
该文章通过公共数据库筛选到YY1可能治疗LN，并通过体内和体外实验加以验证；进一步筛选到一种拮抗YY1的药物rebamipide，使用该药物可显著缓解小鼠LN，且改善机体的免疫细胞表型、减轻肾损伤。总的来说，该研究切入巧妙、表型明显，且验证得当。但遗憾的是，该研究的分子机制研究停留在细胞层面就结束了，我们还并不知道rebamipide或YY1基因如何调控免疫细胞表型、影响了哪些免疫相关信号通路，以及YY1如何发挥其作为关键转录因子的作用等，我们可以期待该研究团队后续的进一步研究成果。
值得一提的是，对公共数据的挖掘得当能够为研究省下不少功夫，其中的GEO和文本数据挖掘、分子对接等“巧劲”，是值得我们学习借鉴的。
参考文献：
Yuan, H., Peng, Z., Zhang, M., Li, H., Lu, K., Yang, C., Li, M., & Liu, S. (2024). Antagonising Yin Yang 1 ameliorates the symptoms of lupus nephritis via modulating T lymphocyte signaling. Pharmacological research, 210, 107525. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2024.107525
概普生物 让科研丰富
