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本文结论亮点
使用技术：FFPE样本的CODEX技术对35例CRC患者140个组织中56个标记物的多重组织成像
空间单细胞蛋白细胞邻域分析：揭示肿瘤微环境的空间组织
低、高危患者空间细胞比例变化：肿瘤组织和免疫成分的改变
预后分析：PD-1+ CD4+ T细胞的局部富集与高危患者的生存相关
抗肿瘤免疫需要免疫肿瘤微环境(iTME)组成部分之间有组织的、空间上细微的相互作用。了解有效和无效肿瘤控制中的这种协调行为将推进免疫治疗。
作者重新设计了检测FFPE样本的CODEX技术，能够同时使用56种蛋白质标记物对35例晚期结直肠癌(CRC)患者的140个组织区域进行分析。作者确定了9个保守的、不同的细胞邻域(cellular neighborhoods，CNs) - CRC iTME 特征的组成部分的集合。在高危患者亚群中，仅在粒细胞CN内富集PD-1+ CD4+ T细胞与生存率呈正相关。肿瘤和免疫CNs的偶联、T细胞和巨噬细胞CNs的断裂以及CN间通讯的中断与不良预后相关。
这项研究为探究复杂的生物过程(如抗肿瘤免疫)如何通过细胞和空间域的协同作用发生提供了一个框架。
本文的分析思路
1：CODEX成像技术数据可以分别进行细胞类型鉴定（cell types、CTs）分析、细胞邻域（cellular neighborhoods、CNs）分析
2：将CTs与CNs结果进行整合分析，得到Coupled modules
3：在CNs结果基础上进行不同区域marker阳性细胞频率统计，预后分析
4：不同邻域间的细胞通讯分析，通讯网络构建
样本选择
淘汰标准：术前治疗、病理肿瘤、结节、转移（pTNM）评分0-2分或未知、免疫浸润缺失（K-M评分0）、G-A得分资料不足、低免疫浸润（KM1）和缺失卵泡（GA0）或少量卵泡（GA1）的组合。最终从715例CRC患者数据库中，选择了17例CLR和18例DII患者的队列，在肿瘤浸润前构建免疫肿瘤微环境的组织芯片（图1B和1C）。
CLR组：其中一组在肿瘤浸润前沿表现出大量三级淋巴组织（TLSs）的从头形成——“克罗恩样反应”（Crohn’s-like reaction，CLR）
DII组：另一组的定义为无TLSs和存在弥漫性炎症浸润（diffuse inflammatory infiltration，DII）
临床特征：CLR患者的总生存期远长于DII患者。
CLR患者中存在TLSs而DII患者中不存在TLSs，表明这两组之间的生存差异可能受到其抗肿瘤免疫反应差异的影响，而不仅仅是肿瘤内在因素。因此，使用CODEX技术比较CLR和DII患者的iTME将使我们能够识别出TLS之外的新邻域。
对FFPE样本优化的CODEX技术
优化的CODEX适用于临床相关组织中高度多重的单细胞标记物可视化、定量和生物标记物发现。
CODEX的工作流以及抗体验证：
图A：CODEX workflow；作者重新设计并完全自动化了CODEX平台，使用迭代退火、成像和剥离荧光标记的DNA探针，与组织结合抗体上的DNA条形码互补。优化的技术使用IHC与HE染色进行了验证（见图S1）。
图B：56-marker CODEX panel，多个肿瘤样本的7色组织芯片概览，7色标记marker在图片底部
图C：选取样本核心区域的高倍放大七色图像
FFPE-CODEX可以对样本iTME中主要免疫细胞类型进行原位识别和定量分析
在结直肠癌侵袭前沿，iTME通常表现为白细胞密集区与稀疏免疫浸润区交替。如前所述，在DII患者中免疫浸润中TLSs（滤泡）缺失，但在CLR患者的肿瘤中含量丰富。因此，作者对两个专门创建的高精度组织芯片进行了56个marker的CODEX，包括每个患者肿瘤浸润前的4个具有代表性的白细胞密集iTME区域，共得到140个区域。
CT聚类：通过使用X-shift进行无监督聚类，然后基于标记物表达谱、组织定位和形态学进行监督聚类合并，识别并验证了28个独特的CT clusters，包括18个免疫细胞簇，6个间质和血管系统簇，2个混合簇，1个肿瘤细胞簇和1个未定义簇。
图A：结直肠癌组织芯片示意图，蓝点代表卵泡/TLSs（三级淋巴结构）。
图B：CLR和DII患者代表性TMA核心采用七色图像描述。
图C：聚类的细胞类型Voronoi图（沃罗诺伊图），合并以降低复杂性
图D：8个免疫Cluster(n = 132,437个细胞)及其在所有CRC患者中的频率(上)，并分为CLR (n = 57,894个细胞)和DII (n =74,543个细胞)(下)。在CLR和DII患者之间观察到这些免疫细胞簇组成的差异，CLR患者的B细胞出现频率更高，而DII患者的巨噬细胞的频率更高。其他没有显著差异。
图E：CLR与DII患者的细胞类型丰度的PCA分析
图F：主成分2中的细胞类型loadings。
结直肠癌免疫肿瘤微环境的细胞邻域特征：在不同病人Group间具有保守性
从细胞形成的空间结构来观察患者样本，而不仅仅是单个细胞的集合，将为iTME的组织过程提供见解。
CN：细胞邻域（cellular neighborhoods、CNs），定义：We identified CNs as regions of the tissue with a specific local density of various CTs。
窗口定义： For every cell in the tissue, its 10 nearest spatial neighbors, which we labeled its ‘‘window,’’ were identified。
作者在CRC iTME中发现了10个不同的CNs，它们再现了核心组织成分，这在原始H&E染色切片和两组患者的荧光图像上得到了验证。除与TLS（滤泡）相对应的CN外，其余8个CNs广泛存在于CLR和DII患者中。接着，作者评估了不同CRC患者组之间CNs的频率是否不同，发现CNs在不同患者组中是常见的，很可能代表了CRC iTME的保守组织隔间。这就提出了一个问题，即这些CNs之间是否有其他的结构和关系，可以解释CLR和DII之间的差异。
图A：CN识别示意图。
图B：识别9个不同的CNs
图C：CLR和DII患者CN代表性Vorsonoi图。插页为H&E图像。
图D &E：选择具有代表性的Voronoi图显示患者33 (D)和19 (E)的9种不同的CNs（左面板）和相应的7色图像（右面板）。插图，H&E图像
图F：CLR与DII患者的CNs频率。每个点代表每个患者四个TMA核的平均CN频率，水平线代表每个患者之间的平均频率（***p < 0.001， Student’s t检验）
DII患者中：肿瘤和免疫成分的偶联与T细胞和巨噬细胞CNs的偶联和碎片化有关
上一个结果中，鉴定的CNs提供了一个不同于CTs的患者样本视角。作者认为：同时从CT视图和CN视图可以更好地理解形成iTME的底层程序。因此，作者考虑对每例样本将CNs和CTs联合得到一个 joint composition matrix，并去掉CN-5(滤泡)的数据，因为它仅存在于CLR患者。该矩阵不仅描述了组织水平上的细胞定位(即，给定类型的随机抽样细胞在给定CN中的概率)，而且还考虑了CN的丰度。联合的CN-CT组成差异应该有助于深入了解iTME过程在患者组之间的差异。
结果表明，在CLR和DII患者中存在潜在的程序差异导致iTME具有不同的空间组织。
图A：the tensor decomposition analysis示意图
图B：CLR患者的分解结果。组织模块（CN模块和CT模块的交互对）对应于“免疫室”（顶部）和“肿瘤室”（底部）。
图C：DII 患者的分解结果。组织模块对应于“免疫和肿瘤室”（顶部）和“粒细胞室”（底部）。
T细胞亚群上功能标记物的邻域特异性表达暗示：Bulk肿瘤中T细胞过程变化
假设：如果每个CN中与抗肿瘤免疫同步相关的生物学过程在患者组之间发生改变，我们可以期望观察到其中相关功能CT的频率同时发生变化。
作者做了一系列模型验证说明：CLR和DII患者之间的CNs的功能状态是不同的，并且CN的功能状态可能与抗肿瘤免疫反应的功能相关。具体来说，通过PD- 1+ CD4+ T细胞的频率显示，富含粒细胞的CN的功能状态与DII患者的总生存率相关。在富含粒细胞的CN中所包含的T细胞亚群活性的某些方面可能有助于免疫活性。
图A：TMA spots的Voronoi图示例。不同颜色表示不同CNs，CN中的点表示CD4+（左）和CD8+ T细胞（右）。
图B：CNs中T细胞频率的Cox比例风险回归结果表。
图C：不同T细胞亚群上ICOS、Ki-67和PD-1染色
图D：每个CN中CD4+ (FOXP3) T细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞至少有一种功能标记(ICOS、Ki-67和PD-1)呈阳性的相对比例。
图E：CN-1、CN-2、CN- 4和CN-6中标记阳性CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞的CN特异性CT频率的小提琴图。
图F：ROC曲线 总的marker阳性细胞频率 vs CN特异的marker阳性细胞频率
图G：差异富集系数的热图，正系数（红色）表示在给定CN中相应的CT更富集。在DII患者中，Ki-67+ Treg细胞在CN-4中更富集，而在CLR患者中，Ki-67+ CD8+ T细胞在CN-1中更富集。
图H：每个患者CN-1中Ki-67+ CD8+ T细胞和CN-4中Ki-67+ Treg细胞的富集
图I：每个CT的CN功能状态改变评分
图J：CN-9中PD-1+ CD4+ T细胞的对数频率与DII患者总生存率的估计对数风险比的部分残差图（p = 0.006；n = 18,13例死亡；Cox比例风险回归）
图K：根据PD-1+CD4+ T细胞CN-9特异性频率将DII患者划分为两组的最佳Kaplan-Meier曲线
相关的CN功能状态提示在DII患者中存在免疫抑制的CN间通信和改变的通信网络
The tensor decomposition 表明不同的CNs可以招募相似的CTs组合，这可以解释为这些CNs之间的一种交流形式。因此，作者假设CNs之间的其他形式的交流可以产生功能状态相关性。这些相关性可能是由生物过程介导的，如免疫细胞浸润、抗原呈递、细胞因子产生或仍有待确定的过程。在DII患者中，相关性分析允许我们观察到CN-1（T细胞富集）和CN-4（巨噬细胞富集）之间可能的免疫抑制程序。此外，患者组之间关于功能性T细胞亚群的通信网络发生了改变，表明这种免疫抑制程序可能影响肿瘤边界和整体肿瘤中功能性T细胞亚群的表型。
图A：各患者组中CN-1（T细胞富集）中Ki-67+ CD8+ T细胞的频率与CN-4（巨噬细胞富集）中treg细胞的频率的相关性。斯皮尔曼秩和皮尔逊相关系数和p值显示。
图B：相关性分析的示意图
图C：将ICOS+、Ki-67+和PD-1+ CD8+ T细胞以及Ki-67+ Treg细胞在每对CNs中频率的典型相关性与每组患者的排列零分布进行比较。观察到的与这些CTs的典型相关性高于90%排列的CNs对通过边连接并可视化为图。
图D：描述CRC iTME空间行为的概念框架
图E：CLR和DII患者之间的iTME在CN组织（图5）、细胞功能（图6）和CN间通信方面的差异模型。
总结
该研究利用CODEX技术和分析框架系统描述了CRC的免疫肿瘤微环境iTME，鉴定了多个CNs并探测了它们的组织、功能状态和通讯关系。
参考文献
Schürch, Christian M et al. “Coordinated Cellular Neighborhoods Orchestrate Antitumoral Immunity at the Colorectal Cancer Invasive Front.” Cell vol. 182,5 (2020): 1341-1359.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.07.005
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