Forestry Res 编委动态 | 中国林业科学研究院李全梓研究员团队揭示PagMYB31协同调控杨树木材发育中的重要作用

2024年5月，中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室李全梓研究员团队在The Plant Cell 发表了题为Transcription factor PagMYB31 positively regulates cambium activity and negatively regulates xylem development in poplar的研究论文，重点实验室博士研究生张艳慧为论文第一作者，文章揭示转录因子PagMYB31在协同调控杨树木材发育过程不同阶段中发挥的重要作用，并构建其介导的转录调控网络。

01 摘要

背景：

发现：突变体和过表达转基因植物的表型表征表明，转录因子PagMYB31正向调控形成层细胞增殖，负调控木质部细胞扩增和次生细胞壁生物合成。作者发现PagMYB31在维持导管形成层稳态的多种途径中起重要作用，以促进或抑制WOX4 的表达。作者还发现PagMYB31抑制形成层细胞和木质部细胞的扩增以及木质部细胞的壁增厚，证明了其在平衡形成层分生组织命运和分化方面的重要作用。PagMYB31可以直接调控形成层细胞增殖和木质部发育的关键基因，使 PagMYB31处于协调木材形成的调控网络的中心。

后续步骤：

本研究表明，PagMYB31在调节形成层细胞增殖和木质部发育（细胞扩增和壁增厚）方面具有相反的功能。将进行进一步的分析，以揭示哪些上游线索或因素调节PagMYB31，并探索培育具有增强生长的树木的策略。

02 研究结果

首先，作者用PagMYB31 的2.5 kb的启动子驱动GUS基因，在维管束中明显观察到GUS染色，在木质部和韧皮部细胞中均有信号。在具有次生生长的干细胞中，在分化木质部的纤维细胞、导管和射线细胞中可以观察到GUS信号，在形成层和韧皮部细胞中也存在可检测到的GUS信号。亚细胞定位分析显示，PagMYB31蛋白定位于细胞核中。

为了研究 PagMYB31在木材形成过程中的功能，创制了PagMYB31 基因的CRISPR/Cas9 突变体材料，细胞学观察表明，PagMYB31突变导致形成层活性降低，但促进木质部细胞扩增和SCW形成（图1）。

图1(G)myb31 突变体和WT植物。对第5节和第10节间茎横截面的细胞学观察显示木质部发育增强。(H)第12节间茎横截面的SEM

同时作者还生成了PagMYB31-OE 和PagMYB31：SRDX 系列。植物特异性乙烯响应元件结合因子（ERF）相关的两亲性抑制 （EAR） 基序阻遏蛋白结构域 （SRDX） 融合到TF的C 末端可以将激活剂转化为阻遏蛋白或增加阻遏蛋白的抑制能力。与WT相比，转基因植株的生长速度减慢。与OE转基因植株相比，SRDX转基因植株的生长下降更为严重，SRDX-19的高度降低了67.5%（图2）。第10节间茎横截面细胞学观察表明，OE和SRDX转基因植株的木质部均比WT窄，SRDX转基因植株的差异更明显。SEM观察表明，SRDX-11和SRDX-19表现出与OE转基因植物相似的表型，具有更小、更薄的导管和纤维细胞（图2）。

图2 Flag：PagMYB31 在白松×腺松中的OE抑制木质部发育和SCW增厚

图3 myb31-7 突变体Flag：MYB31 和MYB31：SRDX 转基因杨树分化木质部的转录组分析

为了研究 PagMYB31的扰动如何影响SCW生物合成，作者通过染色质免疫沉淀 （ChIP）-seq和RNA-seq（来自突变体和 OE 转基因植物）的组合确定了 PagMYB31的直接靶标。使用抗Flag抗体在Flag：PagMYB31-OE转基因系 OE-5和 OE-17中进行 ChIP，然后对免疫沉淀的DNA片段进行测序。为了确认 ChIP结果，作者选择了11个基因（PagMYB21、20/3、SND1-A2、MYB158、NAC127、CAld5H2、AUX1、XCP2、TBL33 和TBL38）进行酵母 1 杂交（Y1H）和效应报告基因测定。Y1H测定中，含有这11个基因每个启动子的诱饵酵母菌株不能在补充有3-氨基-1,2,4-三三唑（3-AT）的培养基上生长（图4）。当PagMYB31转化为诱饵菌株时，酵母可以在补充3-AT的培养基上生长，表明PagMYB31可以激活这些启动子。在效应子-报告基因测定中，与对照组（仅转化的报告基因构建体）相比，每个共转化中的LUC活性降低，表明PagMYB31的瞬时OE抑制了这11个基因的表达（图4）。Y1H 和效应子-报告基因检测均支持 PagMYB31的 ChIP 结果和阻遏蛋白活性。

myb31 突变体的形成层细胞层数少于WT，而OE转基因植物形成层细胞层数增加，表明PagMYB31正向调节形成层活性。为了检查形成层细胞中的基因表达，从树皮侧刮下组织并用于RNA-seq。

作者研究了在杨树形成层中起作用的蛋白质的基因，包括PagWOX4、VCM1/2 和MYB199。在myb31-7 突变体中，PagWOX4a/b 的转录丰度显著低于WT，其中PagWOX4b 的转录丰度特别低。RT-qPCR证实了PagWOX4、VCM2、PIN5 和MYB199 在突变体中的下调（图6）。

在snRNA-seq分析中，基于PagWOX4 在这两个簇中的上调，将簇7和13表征为形成层细胞。观察到 PagWOX4b 和 CLE47 在 myb31-7 突变体的第 13 簇中下调，PagWOX4b 和VCM2 在myb31-7 突变体的第 7 簇中下调 （图 5），这与RNA-seq结果一致。在空间转录组分析中也检测到PagWOX4 在形成层区域的下调。结果表明，PagMYB31突变影响了形成层增殖相关基因的表达。

在韧皮部形成层中整合ChIP-seq和RNA-seq确定了 PagMYB31的几个直接靶标，包括 PagWOX4、VCM2、MYB199、CLE47和MYB72，ChIP-qPCR（图 5D）。Y1H 检测也支持 PagMYB31 结合这 5 个基因的启动子（图 5E）进一步的效应报告基因试验表明，PagMYB31可以激活 PagWOX4b、CLE47 和 VCM2 的启动子活性 (图 5F），证明PagMYB31直接正向调控这3个基因。虽然作者没有检测到 PagMYB31对CLE44 基因的直接调控，但作者观察到 PagCLE44D 在韧皮部形成层中上调，表明 CLE 肽在 PagMYB31介导的形成层活性调节中发挥作用。

图5  PagMYB31直接调控参与形成层增殖的基因的表达

图6  PagMYB31介导的TRN调节木材形成的不同发育步骤，包括形成层细胞增殖、木质部细胞扩增和SCW生物合成

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