内参基因（RG）是在不同的植物组织、发育阶段或生理条件下，表达水平稳定且不受环境条件影响的基因。在利用RT-qPCR 进行基因表达水平检测中，选择合适的RG至关重要。在许多植物中，人们通常从细胞的持家基因中选择RG，例如GAPDH、tubulin、actin、UBQ 和UBC 等。然而通过对模式植物中RG 的验证和对转录组数据的全面挖掘，人们发现RG表达稳定性受到不同植物物种、不同细胞/组织/器官类型以及不同生长条件的影响，这些常用的RG 在转录本丰度上经常存在明显差异。即便在特定实验条件下或组织类型中，这些常用的RG也可能存在表达差异。因此，在使用RG对RT-qPCR 数据进行归一化之前，验证其自身表达稳定性非常重要。只有那些经过表达稳定性验证的RG候选基因才能被称为特定生长条件或特定组织类型的RG。
2024年5月，Forestry Research 在线发表了华中农业大学植物维管生物学实验室题为A
protocol for identifying universal reference genes within a genus based on
RNA-Seq data: A case study of poplar stem gene expression 的文章。
该研究利用从公共数据库下载的杨属不同树种、不同组织、不同发育阶段以及不同胁迫处理的298个与茎相关的RNA-Seq 数据，开发了一种鉴定属内通用内参基因的方法。通过比较分析4种不同的均一化方法，选用DESeq2法对RNA-Seq 基因表达数据进行均一化，并基于变异系数（CV）筛选出12个在不同条件下表达最稳定的候选RG。利用候选RG在杨树不同树种中的同源序列设计通用的基因特异引物，采用RT-qPCR 技术评估这12个候选RG 和6个已报道RG在不同非生物胁迫条件下或不同杨树茎中的表达水平，并使用ΔCt、geNorm、NormFinder 和BestKeeper 进一步评估所选基因的表达稳定性，发现所有候选RG均有稳定表达。该研究最后使用包含117个RNA-Seq 样品的测试数据集进一步确认了候选RG的表达稳定性，其中6个候选RG和3个已报道RG满足CV≤0.3的要求。综上所述，该研究基于筛选杨树茎通用候选RG的案例分析，建立了一个基于RNA-Seq 数据进行通用RG开发的流程，确定了Potri.001G349400（CNOT2）为开展杨树茎基因表达研究的最佳候选RG，给出了用于扩增该RG基因的杨属通用引物（Forward: GGTCTGACGAGCCAGCAAAGGGT; Reverse: CGCCGCTGCTCCTTGTGGT）。
图1 基于RNA-Seq 数据鉴定新内参基因（RG）的工作流程
团队介绍：
华中农业大学植物维管生物学实验室主要以杨树为研究对象，进行木材形成分子机制研究和种质创新，实验室主要成员郑波教授和施雪萍副教授在植物多肽激素和miRNA调控植物维管发育研究中取得了多项成果，研究结果发表于Briefings in Bioinformatics、Horticulture Research、Science of the Total Environment 等期刊上。
原文链接：
https://doi.org/10.48130/forres-0024-0017
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