发酵制品：胶原蛋白的发酵工艺特征及28型胶原蛋白综述

胶原蛋白凭借自身出色的生物相容性以及多样的功能性，在众多领域中得到了极为广泛的运用。胶原蛋白这一庞大的家族包含多达 28 种类型，它们各自具备独特的生物功能。尽管在利用重组技术获取胶原蛋白方面已经获取了一定程度的进展，然而当下所制备的重组胶原蛋白，在产量以及纯度方面依旧存在着进一步提升的可能性。可以坚信的是，伴随基因工程、蛋白质工程技术等分子生物学研究的迅猛发展，在未来能够通过深入探究影响蛋白高效合成的通路以及特定修饰所涉及的关键酶节点，借助分子定向设计、基因串联以及多步纯化等手段，同时对发酵和纯化工艺进行更深入的优化，从而有希望获取产量更高、纯度更优、分量各异且用途多样的类人胶原蛋白，进而进一步达成重组胶原蛋白在食品、化妆品以及生物医药等领域的应用价值。与此同时，我们有理由相信重组技术的发展在未来将会在能源、农业、食品生产、工业化学以及药品制造等诸多方面取得极为丰硕的成果，为解决全球范围内的棘手难题贡献力量。

胶原蛋白是一种生物高分子，具有以下特点：

1. 结构特点：由三条多肽链组成独特的三螺旋结构，富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸。
2. 物理特性：具有良好的拉伸强度和弹性，为组织提供支撑和韧性。
3. 生物活性：参与细胞黏附、迁移和分化等过程，对组织的生长、修复和再生起着重要作用。
4. 应用领域：广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。在食品中可作为营养补充剂，增强食品的营养价值和口感；在化妆品中用于保湿、抗皱和紧致肌肤；在医药领域可用于制作伤口敷料、药物载体和组织工程材料等。

1. Bentley 等将脂蛋白表达在大肠杆菌中生产重组蛋白，并探讨了生产重组蛋白过程中的工艺条件，为莱姆病的治疗提供了可能；
2. Rutschmann等在大肠杆菌中表达了羟化重组Ⅲ型类人胶原蛋白，获得的重组蛋白具有良好的生物相容性，可以促进脐内皮细胞的生长；
3. 张珊珊表达重组细菌胶原蛋白VCL，该重组胶原蛋白在大肠杆菌系统中高效表达 （0.1～0.12g/L），且无免疫原性、无细胞毒性，可以有效促进骨缺损，成为一种潜在的生物材料；
4. 王皓利用基因工程构建重组胶原蛋白，表达量为34.2%，具有优异的抗氧化活性，对羟基自由基以及超氧阴离子有很好的清除力；

5. 范代娣课题组表达的利用大肠杆菌发酵获得的重组类人胶原蛋白和胶原蛋白相比具有组分单一、过程可控、生产周期短、产物可控、无病毒隐患等特征，同时通过大肠杆菌表达全长重组胶原蛋白α1链。

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1.在大肠杆菌高密度表达中，稳定的pH是使菌体保持最佳生长状态的必要条件，外界pH会影响菌体的胞内pH，从而影响细菌的代谢反应，因此发酵过程中pH的改变会影响细胞的生物量以及重组胶原蛋白的合成，当pH为6.5时，外源蛋白含量最高，达到33.31%。

2.温度是影响大肠杆菌生长以及诱导重组蛋白表达的最主要因素之一，因为任何生物化学的酶促反应都与温度变化密切相关。随着培养温度的下降，菌体浓度（OD600）小幅降低，但胶原蛋白表达量明显升高，30℃时外源蛋白表达率高达30.5%。这归因于在诱导后低温培养降低了菌体比生长速率，更多的营养源用来合成目的蛋白；低于30℃时重组蛋白表达率也随之降低，可能由于培养温度过低，严重抑制菌体比生长速率，导致菌体密度过小而降低蛋白表达。

3.溶解氧（DO）是发酵过程中影响菌体生长的另一重要因素，DO过高或过低都会影响大肠肝菌的代谢和目的蛋白的表达。当DO为40%时，菌体会过早地到达平稳期从而导致蛋白表达期过短，影响胶原蛋白的合成。DO 为10%时，菌体呼吸强度偏弱，容易进入厌氧代谢途径积累有机酸，因此最适 DO 为 30%。

4.葡萄糖浓度为10g/L时，重组菌的细胞密度和蛋白表达量分别达到 4.5 和 15.55%。

5.蛋白胨作为有机氮源时，在浓度为15g/L时，细胞密度达到最大值4.62，但是蛋白表达率在蛋白胨浓度为10g/L时已经达到峰值（15.97%），因此混合氮源为10～15g/L时，细胞密度和蛋白表达量均达到最高。葡萄糖和氮作为两种营养源直接影响细菌生长状态以及蛋白表达量，因此需要寻找合适的葡萄糖浓度以及氮源浓度。

6.乙酸是大肠杆菌发酵过程的副产物，会抑制细胞生长和胶原蛋白生成，需要不断从培养液中移去乙酸，但是乙酸去除过程也伴随着营养物质的损失。事实上，乙酸被部分氧化代谢，属于一种潜在的碳源和能源，因此使大肠杆菌同化乙酸来控制乙酸含量是一种可行新颖的方法。通过切断糖供应使其处于饥饿状态可以有效地避免乙酸积累。

7.在分批培养结束后、分批补料培养诱导前和诱导后三个阶段不同阶段断糖使饥饿，细胞干重、蛋白浓度和乙酸浓度都是不同的，研究结果表明，在诱导后糖饥饿，蛋白浓度最低 （1.5g/L），细胞干重也较低，而在诱导前断糖，蛋白浓度（13.2g/L） 和细胞干重均最大，乙酸浓度最低。 因此，选择合适的时间糖饥饿可以有效地控制重组蛋白表达量。

毕赤酵母近年来在重组蛋白表达领域应用广泛。它可以高效表达外源蛋白，并且通过合适的发酵策略和优化，可以获得较高产量的胶原蛋白。毕赤酵母表达系统能够对胶原蛋白进行较为复杂的翻译后修饰，有助于提高胶原蛋白的质量和活性。

大肠杆菌原核表达缺乏真核翻译后系统，过量表达的动物蛋白的不溶性，胞内表达较难纯化等不足促进了酵母、动植物等表达系统的发展。酵母表达因其成本较低、易高细胞密度发酵、不产生内毒素而简化了纯化及灭菌过程等受到研究者的广泛关注。

1. Xi等在毕赤酵母中成功表达了鸡Ⅱ型胶原蛋白；
2. Kivirikko在毕赤酵母菌中成功高效表达了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型重组胶原蛋白，获得的重组蛋白具有稳定的结构及热力学稳定性；
3. Toman等在酵母中表达Ⅰ型重组胶原蛋白；
4. 徐立群表达了重组Ⅵ型胶原蛋白，为其活性功能的探讨及其生产奠定基础；
5. 刘斌以人胶原蛋白为模板，在酵母细胞中表达类人胶原蛋白，最高表达量达 3.81g/L；

   范代娣课题组实现了人Ⅲ型胶原 α1 链蛋白和羟脯氨酸的高效表达。

毕赤酵母的醇氧化酶基因的启动子具有强诱导性和强启动性，可有效调控外源基因的高效表达。毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，因此可进行细胞高密度培养，有利于大规模工业化生产。此外，其分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，纯化也更为方便。在酵母发酵过程中，甲醇诱导阶段甲醇作为营养源的添加量是影响目的蛋白表达量的重要因素。同时，温度、pH和溶解氧均直接影响胶原蛋白的表达量以及菌体浓度。为了使重组胶原蛋白表达量最大化，需精确调控甲醇含量、温度、pH以及溶解氧各个参数到最优值。

1. 当pH为4.69，诱导温度为 28.23℃，甲醇添加量为 2.13%/24h 时，类人胶原蛋白表达量最大，理论值为27.84mg/L； 
2. 甲醇做碳源时可诱导毕赤酵母表达外源基因，但甲醇流加不足或过量都会影响到毕赤酵母表达外源蛋白的水平，高浓度的甲醇抑制细胞的生长和产物表达，因此控制甲醇流加是提高外源蛋白表达量的关键，通常根据溶氧控制甲醇流加。但如果某一时刻甲醇流加过量导致细胞的生长受到抑制，菌体的耗氧速率下降，误以为是甲醇浓度较低，从而增大流加速率使甲醇浓度越来越高，因此利用溶氧控制毕赤酵母发酵过程中甲醇的流加不是一种有效的方法； 
3. 微生物发酵过程中，pH、DO等参数反映碳源的消耗情况。当碳源消耗完，DO会上升，如果再加入碳源，由于微生物利用碳源消耗氧，使DO下降。利用这个原理可根据DO的变化控制毕赤酵母发酵过程中甲醇的流加；
4. 一组优化后的发酵条件：取诱导温度 28.22℃，诱导初始 pH 为4.98，甲醇添加量 1.35%/24h，其他条件不变，试验重复三次，得到重组人Ⅲ型胶原α1链蛋白表达量的实际平均值508.46mg/L。