高菌种筛选技术分享正在直播中(2024.9.28早9:00-11:00),微信视频号【酵脑风暴】可自由观看交流。
发酵液中的溶氧浓度(Dissolved Oxygen ,简称DO)对微生物的生长和产物形成有着重要的影响。在发酵过程中,必须供给适量的无菌空气,菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。一般而言氧气不容易溶解,25℃的大气压力条件下,氧气溶解在水中的浓度大约只有0.25mmol/L。发酵过程中的发酵液以及微生物的代谢产物都可以明显降低氧的浓度。
不同菌种及不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的,发酵液的 DO 值直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。发酵过程中,氧的传质速率主要受发酵液中溶解氧的浓度和传递阻力影响。研究溶氧对发酵的影响及控制对提高生产效率,改善产品质量等都有重要意义。
01
微生物对氧的需求
根据对氧的需求,微生物可分为专性好氧微生物、兼性好氧微生物和专性厌氧微生物。
(1) 专性好氧微生物把氧作为最终电子受体,通过有氧呼吸获取能量,如霉菌;进行此类微生物发酵时一般应尽可能地提高溶解氧(DO),以促进微生物生长,增大菌体量。
(2) 兼性好氧微生物的生长不一定需要氧,但如果在培养中供给氧,则菌体生长更好,如酵母菌;典型的如乙醇发酵,对溶氧DO的控制分两个阶段,初始提供高DO 值进行菌体扩大培养,后期严格控制 DO 进行厌氧发酵。
(3) 厌氧和微好氧微生物能耐受环境中的氧,但它们的生长并不需要氧,这些微生物在发酵生产中应用较少。而对于专性厌氧微生物,氧则可对其显示毒性,如产甲烷杆菌,此时能否限制 DO 在一个较低值往往成为发酵成败的关键。
02
影响溶氧浓度的因素
一般情况下,对发酵液溶氧浓度影响较大的物理参数有:发酵罐的通气量、搅拌速度、发酵罐温度压力等。
2.1. 发酵罐通气量
发酵罐通气量的影响是最直接的。影响溶氧浓度最主要的因素是进入发酵罐中无菌空气(或是纯氧)的量。因为在发酵过程中,随着微生物的快速生长进入对数生长期,菌体耗氧量明显增多,这时如果终止进气的补给,发酵液中的氧将很快被微生物耗尽。在工业生产中通常在进气管路上安装阀门来对通气量进行调节。
2.2. 搅拌速度
对溶氧电极本身来说,其在工作中会消耗大量的氧。溶氧电极的信号与氧渗透隔膜向电极表面传递的速率成比例,而氧的传递速率则由氧的跨膜扩散速率来控制。氧的跨膜扩散速率与氧溶解在发酵液中的浓度成比例,其比值取决于总的传质过程。其中氧的跨膜扩散过程是整个传质过程的限速过程。在发酵操作时,适当的搅拌操作可以获得较好的跨膜扩散速率,从而使电极响应的信号较佳,获得比较准的读数。另外,搅拌通过防止气泡聚集;使液体形成湍流,增加气液接触时间;将空气通过搅拌桨叶端的高速剪切力破碎成小气泡,从而明显增大有效气液传递面积来增加发酵液中的溶氧浓度。需要强调的是,在对溶氧电极进行最初斜率(溶氧量100%)校准之前,必须对发酵罐进行搅拌。
2.3. 温度的影响
溶氧电极的信号随温度的升高而显著增强,这主要是由于温度对氧的跨膜扩散速率的影响。发酵过程中需要控制发酵罐的温度,因为即使0.5℃左右的温度变化,也会使电极信号发生显著变化(超过1%)。有文献报道当发酵温度在30℃附近时,温度变化引起的溶氧电极测量值偏差大约为3%/℃。溶氧示数的周期性变化(每隔几分钟观察一次)反映了温度变化的影响,而且较大的温度波动能引起校准时的较大漂移。因此在发酵过程中改变温度时要格外小心。在设置发酵罐的操作温度之前,需要对溶氧电极进行标定。基于上述因素的存在,一些溶氧电极自带有温度传感器等仪表,以实现温度的自动补偿。此外,对于具有计算机监控的发酵罐,可利用独立的温度传感器信号,由相关软件实现温度补偿。
2.4. 压力的影响
03
溶解氧对发酵的影响
3.1. 溶解氧对微生物生长的影响
溶氧浓度过高对微生物的生长不利。研究表明过高的溶氧除了生产过大的动力消耗外,还会产生大量泡沫,同时 DO 过高也会产生新生氧、超氧化物基或羟基自由基,而破坏微生物细胞组分。有学者在对球形芽孢杆菌(Bacillus sphaerlcus)的芽孢的形成与DO的关系进行了研究,结果发现在一定 DO 范围内,发酵液中芽孢的形成量随DO的增加而增加,但 DO 过高时,发酵液中芽孢的形成量下降。推测其可能原因是当球形芽孢杆菌处于对数生长期和芽孢形成期时,充足的通气量使得发酵液中的溶氧水平升高,有利于芽孢的产生;但当球形芽孢杆菌处于稳定期和衰亡期时,通气量过大导致出现溶解氧过量,菌体出现自溶,反而使芽孢的形成量降低。
发酵液中的DO会直接影响微生物酶的活性及代谢途径,进而影响微生物的生长和代谢产物的积累,并最终决定代谢产物产量的高低。有学者研究了不同溶氧对谷氨酸发酵中的两个关键酶(谷氨酸脱氢酶GDH和乳酸脱氢酶LDH)和代谢流向的影响,研究表明在 DO 很低的条件下,三羧酸循环途径减弱,不足以与葡萄糖酵解途径的速率相平衡,从而促进了LDH的活性,使代谢转向乳酸的生成,造成乳酸积累;而在DO很高的条件下,GDH活性明显降低,且三羧酸循环途径增强,生成大量CO2,造成碳源损失,两种情况均不利于谷氨酸生成。
在啤酒工业中,啤酒的各个发酵阶段中对DO的要求是不同的。例如在早期阶段,需要有足够的氧气来促进酵母的生长增殖,此后的每一个阶段都应严格控制氧的摄入。因为氧气的存在会促进酵母的有氧呼吸的代谢途径,从而抑制了其向乙醇发酵的无氧代谢过程。但是,研究表明无氧条件下产生的乙醇低于溶氧控制在1~4%条件下产生的乙醇。这主要是由于无氧条件下的酵母量远远低于有氧条件下酵母量,而乙醇的产生与酵母量有很大的关系。
3.2. 溶解氧对代谢产物的影响
不同微生物的不同发酵阶段,其对需氧量的要求是不同的,学者在研究溶解氧对耐热链霉菌A80生物转化泰乐菌素为其酰化物的影响中发现,该生物转化发酵过程与一般抗生素的发酵阶段不同,它存在两个摄氧率高峰阶段。
而同一微生物的不同发酵阶段,微生物的需氧量也是不同的。在发酵生产透明质酸(HA)的过程中,DO对于HA分子量的影响是两个相反的作用相平衡的结果。一是溶氧的增加有利于高分子量HA的合成。适当地增加溶氧促进合成大分子量 HA 的原因是 HA 是菌体英膜的一种成分,它可以保护 A族和 C 族链球菌免受外界氧自由基的侵袭;另一个是过高的的DO 又可促进氧自由基的产生,降解 HA 大分子。50%溶氧值是一个临界点,高于此浓度 HA 分子量不升反降。
DO是微生物发酵中的一个重要因素,好氧发酵中通常需要供给大量的空气才能满足微生物对溶氧的需求。研究表明DO对枯草芽孢杆菌 B47产生抗菌物质影响最大,且具有负效应,即DO多,菌株产生的抗菌物质越少。DO不仅影响次生代谢产物的合成途径,也会影响代谢的合成速度。在氨基酸的发酵过程中,由于氨基酸生产菌大多为需氧菌,即必须供给适量的无菌空气,菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。研究者以 L-苏氨酸生产菌TRFC为菌株分批发酵生产L-苏氨酸,研究了不同DO 对 L-苏氨酸合成的影响,结果发现,DO 多即氧气供应充足时,菌株新陈代谢旺盛,有利于菌株的生长。此外,草酰乙酸作为 L-苏氨酸的前体物,它主要由三羧酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应产生,而该反应对DO的要求很高,充分供氧可使菌株呼吸充足,也有利于酸的产生和氨基转换作用。
04
溶氧浓度的调控
对溶氧浓度调控的主要目的是为了使发酵液中 DO维持在一定限度或范围内,以保证微生物的最适生长及代谢条件,尽可能多的获得质量优良的代谢产物。溶氧控制主要参考DO测量值、发酵罐通气量监测值、发酵罐搅拌速度、发酵罐压力、发酵温度等进行综合考虑。在微生物的发酵过程中,DO与其他发酵过程的参数的关系极为复杂,受到生物反应器中多种物理、化学和微生物因素的影响和制约。对DO 的控制主要集中在以下3个方面:
4.1. 控制溶氧量
控制溶氧量(C*-CL)是氧溶解的推动力,控制溶氧量首要因素是控制氧分压(C*)。高密度培养往往采用通入纯氧的方式提高氧分压,而厌氧发酵则采用各种方式将氧分压控制在较低水平。如啤酒发酵,麦汁充氧和酵母接种阶段,一般要求氧含量达到8~10PPM;而啤酒发酵阶段,一般啤酒中的含氧量不得超过2PPM。
4.2. 控制氧传递速率
氧传递速率主要考虑KLa的影响因素。从一定意义上讲,KLa愈大,好氧生物反应器的传质性能愈好。控制KLa的途径可分为操作变量、反应液的理化性质和反应器的结构3个部分。操作变量包括温度、压力、通风量和转速(搅拌功率)等;发酵液的理化性质包括发酵液的黏度、表面张力、氧的溶解度、发酵液的组成成分、发酵液的流动状态、发酵类型等;反应器的结构指反应器的类型、反应器各部分尺寸的比例、空气分布器的形式等。当然有些因素是相互关联的。
4.3. 控制微生物的摄氧率
与微生物摄氧率有关的因素包括:微生物种类、接种时微生物的生长状态、接种量、是否感染杂菌等。而对于需氧型发酵而言,接种量越多,耗氧量越多,摄氧率越高,DO下降越快。当发酵过程中DO出现剧烈波动,同时发酵液的pH也急剧变化,说明发酵液污染了其他杂菌。
05
结束语
发酵液中的氧含量对菌体生长和产物形成都有着重要的影响,溶氧量的控制主要从氧的溶解、氧的跨膜传递速率和微生物的摄氧率三方面考虑。酵过程中 DO 的控制是一个动态的过程,要根据实际的发酵情况,再配合使用各种调节手段以使发酵液中的 DO 处于合适水平。发酵工业中从 DO 的测量到分析控制都正逐步走向自动及控制一体化模式,总之利用 DO 作为补料的在线控制信号将大大提高了发酵调控的准确性和自动化性能。