发酵工艺:浅析嗜酸乳杆菌发酵(菌株筛选、发酵条件、浓缩富集及干燥保存)的研究

企业   科学   2024-08-27 10:48   陕西  

1
 什么是嗜酸乳杆菌

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)属于乳杆菌属,为革兰阳性无芽孢杆菌。其形态多数呈现细长杆状,分布较杂乱,以单个、成双或短链出现,菌落边缘较粗糙且不规则,通常呈中间向两边放线状分布,颜色较透明。对营养物质的需求较为复杂,需要碳源、氮源、缓冲盐、微量元素、维生素和核苷酸等多种营养物质共同为其生长繁殖提供能量。嗜酸乳杆菌的最适生长温度为35~42℃,低于20℃或者高于48℃均无法生长。耐酸性较强,能在低酸性环境中生长繁殖。广泛分布于动物和人类微生物体系中,是类便、口腔和阴道中的常见微生物菌群。当在人体肠道内达到一定数量时,它能有效地调节肠道内菌群平衡,维持宿主肠道健康。目前嗜酸乳杆菌是国内外极其重视的益生菌之一,已经被批准可以应用于功能性食品和婴幼儿食品中。广泛应用于商业益生菌产品,包括酸奶、嗜酸性牛奶、奶酪和膳食补充剂等。

2
 嗜酸乳杆菌的保健性能

2.1
 益生菌保健产品

按照FAO/WHOFood and Agriculture Organization/World Health Organization))的定义,益生菌是指服用一定数量后对宿主有益的活的微生物。益生菌包括嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌 、婴儿双歧杆菌与嗜热链球菌等多种菌株,每种菌株都具有其独特的免疫调节功能。此外,还有一些酵母菌与酶亦可归入益生菌的范畴。从广义上来说,益生菌经由口或其他粘膜途径进入宿主体内之后,其中的活菌、死菌及益生菌的代谢产物,可以调节粘膜表面上微生物或者酶的平衡,以及提高系统特异性或非特异性的免疫活性,从而缓解由微观生态失调而引起的肠道功能紊乱,改善人体的健康状态。

2.2
嗜酸乳杆菌的保健性能

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属,革兰氏阳性杆菌,杆菌的末端呈现圆形。实验乳杆菌主要生存于小肠中,能够分泌抗生素类物质,例如嗜酸乳菌素、嗜酸杆菌素、乳酸菌素等,可对肠道致病菌产生拮抗作用,调整肠道内的菌群平衡,具有较高的营养保健作用,是益生菌类保健产品中常见的主要菌种之一。嗜酸乳杆菌的具体保健性能如下图所示:

(1)缓解乳糖不耐受

乳糖是人体及乳制品中的重要营养元素,在体内发挥着重要的作用。乳糖不耐受患者是由于其机体中分解乳糖的内源性乳糖酶匮乏,导致摄入的乳糖无法充分分解和吸收。当机体饮用牛乳后,大量的乳糖存留于肠道内,导致等渗性水储留,产生大量气体造成排气鼓肠、腹胀、腹泻等肠胃疾病。而嗜酸乳杆菌具有较高的耐酸、胆盐耐受能力,不易被上消化道的不利环境杀死,可以通过乳糖诱导产生β-半乳糖苷酶,从而充分分解乳糖,起到缓解乳糖不耐症的作用。

(2)降低胆固醇

胆固醇在人体内含量丰富,尤其在表皮组织、脑、肝脏中含量极高。目前人类不合理的饮食习惯造成了胆固醇的过多积累,从而可能会引起一些列的心血管病症,如冠心病、血管堵塞、高血脂、动脉硬化等,因此寻找降低胆固醇的方法成为了目前的热议话题。

(3)抑制腹泻

目前,探究乳酸菌对肠道的调节功能已经成为了热点研究话题,众多试验研究证明了嗜酸乳杆菌对治疗腹泻和缩短腹泻时间有一定的功效,能够很好的定殖于人体肠道,有效抑制致病菌的生长,调节宿主的菌群平衡。在其生长过程中会产生对病原菌和腐败菌有一定拮抗作用的代谢产物,能够有效的抑制体内有害微生物的生长和繁殖以及毒素的分泌,起到平衡宿主肠道微生物菌群的作用,从而治疗由致病菌引起的腹泻。

4
筛选优良菌株

在研究益生菌的过程中,菌种的选择和获取非常关键。一般的选择方法是,从健康婴儿的粪便中获得多株乳杆菌,然后使用益生菌功能评价技术进行筛选,发现优良的菌株。接着,使用表型和基因型鉴定,发现这些菌株中的嗜酸乳杆菌具有最佳的生理特性,并选择其中的优良菌株进行后续的研究。为了保证菌种质量和稳定性,需要对嗜酸乳杆菌进行良好的保存和管理。一般而言,菌种应保持在菌龄的稳定期,在生长良好、新鲜的菌种斜面中,制备冷冻管。然后将冷冻管放在4℃的冰箱中,存储在干燥、避光的环境中。如果冷冻管内的菌株存活率低或者保存时间超过5-10年,则需要重新分离、筛选、复活,制备新的冷冻管,以保证菌种的质量和稳定性。

当需要使用冷冻管中的嗜酸乳杆菌时,需要进行恢复培养。通常的方法是在平板上划线分离和纯化菌种,将斜面或平板放在恒温箱内,在36±1℃下培养48-72小时。通过分离和纯化,对菌种进行鉴定和检测,确保其质量和稳定性。在生产和使用过程中,生产用菌种可使用斜面或甘油管进行短期保存。斜面置于4℃冰箱中保存,而甘油管置于-18℃冰箱中保存。一般而言,斜面的保存期限不应超过3个月,而甘油管的保存期限则不应超过1年。

5
嗜酸乳杆菌的发酵条件

发酵密度的高低是影响嗜酸乳杆菌在后期加工、储藏过程中活性与稳定性的重要因素,因此,优化包括培养液的成分、pH、发酵时间与温度等因素在内的发酵条件,是提高嗜酸乳杆菌活菌数的基础。查阅文献,总结研究及生产中使用的发酵条件如1表所示,其中,MRS培养基(配方如表2所示,需调节pH6.2-6.4,用高压锅在 121C灭菌 15min)是最常使用的嗜酸乳杆菌的发酵培养基,我们可在MRS培养基的基础上,分别采用单因素试验法优化培养基的成分,正交试验设计法优化各成分的用量,以缩短培养时间并提高活细胞密度。有研究表明,培养基在灭菌消毒的过程中,含有的葡萄糖非常易于与“磷元素”发生反应形成有毒性的棕黑色物质,从而营养成分被大量破坏,发酵产酸、产菌变缓慢。而双糖对热的稳定性好于单糖,可应用于嗜酸乳杆菌的生产。
表1 常用发酵条件
条件
内容

碳源

葡萄糖、蔗糖、乳糖、益生元(作为辅助碳源)

氮源

蛋白胨、大豆粉、肉膏、玉米浆,以及其他有机或无机含氮化合物

营养源

适当的豆芽汁、番茄汁、胡萝卜汁、麦芽汁、蔬菜汁与无机盐

pH

起始pH5.0-9.0之间

发酵温度

35-38

发酵时间

发酵终点以pH3.0-5.0间为计

表2 MRS培养基配方表

组成成分

含量(每1000mL溶液中)
蛋白胨
10.0g
牛肉浸膏
10.0g
酵母膏
5.0g
葡萄糖
20.0g
吐温80
1.0mL
磷酸氢二甲
2.0g
醋酸钠
5.0g
柠檬酸氢二铵
2.0g
七水合硫酸镁
0.25g
四水合硫酸锰
0.05g
琼脂粉
14.0g
5
 嗜酸乳杆菌的浓缩富集

超滤法和高速离心法是两种浓缩富集菌体的方法。超滤法对设备要求较高,而且操作条件不易控制,容易污染菌种,因此离心分离法更常用。离心分离法是通过使用强大的离心力将物质根据其沉降系数、密度和质量进行分离、浓缩、纯化。虽然这种方法操作简便,不易污染,但是离心后上清液中仍然残留一些菌体,导致菌体数量上的损失。此外,离心作用中的剪切力非常大,这会对菌体细胞产生一定的机械损伤,甚至直接导致部分菌体死亡。因此,在离心分离的过程中,离心转速、离心时间和离心温度等离心条件对菌体密度影响较大,需要根据实际情况进行优化调整。

一种改进的离心分离方法是差速离心法,它通过控制菌体位置和离心力大小,能够在不引起过度剪切力的情况下,使菌体得以更好的保存和回收。差速离心法主要依靠菌体和环境溶液之间的分离,以克服离心过程中菌体受伤、死亡和未回收的缺点。因此,差速离心法在杀伤率低、菌株生长慢的情况下,逐渐替代了传统的大离心。总而言之离心分离法虽然操作简便,但会导致一定损失和损伤,需要对离心条件进行合理调整,或者使用差速离心法等改良技术,以提高菌体的保存和回收效率。

6
酸乳杆菌的干燥稳定性

冷冻干燥或喷雾干燥是生产嗜酸乳杆菌干菌粉的最后一个过程。由于冷冻干燥的整个过程都在低温下进行,相比于喷雾干燥,冻干的菌体更易存活,所以产品生产中常采用冷冻干燥法,包括三个步骤预冻结、升华干燥或称第一干燥阶段)和解析干燥(或称第二干操阶段)。冷冻干燥法的显著优势 

1) 低温下蛋白质、微生物等热敏性物质等不会变性或失活,微生物的生长和酶的作用也受到抑制

2) 干燥后制品的体积和形状变化小,有利于保持其原有结构,并且干燥后的制品疏松多孔,呈海绵状,复水性好

3) 干燥在真空条件下进行,可保护易氧化物质,保存期长
然而,冷冻干燥过程仍将不可避免地对生物分子和微生物造成损伤,主要包括冷冻损伤和干燥损失。冷冻损伤发生在预冻结过程中。环境温度的降低使得细胞内外的自由水形成冰晶,在这过程中产生的机械力可以刺穿或破坏细胞膜,引起细胞内物质的外泄,造成细胞死亡。同时,冷冻过程会造成细胞电解质浓度的增加与pH值的改变,当离子渗透的屏障被破坏后,渗透压发生改变,可引起蛋白质的变性,最终导致细胞死亡。在干燥过程中,因结合水的失去,细胞膜的结构、性质和功能会产生变化,从而影响到微生物的生命活动。除去大部分结合水后,磷脂双层膜相互靠近时可发生膜融合现象,膜的相变温度也将升高,易在室温下从液晶相转变为凝胶相或六角相,而在某些温度下相邻的磷脂不完全相变时,会产生侧向相分离现象。膜融合、相变、侧向相分离等现象均会导致膜完整性的破坏,造成细胞的损伤甚至死亡。

目前,为了提高嗜酸乳杆菌的冻干残存率,添加冷冻干燥保护剂是实际生产中一种经济实用的方法。冻干燥保护剂可以改变样品冻干时的物理、化学环境,减轻或防止冷冻干燥或复水对菌体的损害,尽可能保持菌体原有的各种生理生化特性和生物活性。

直播即将开启,欢迎关注(2024年8月28 早9:00-10:30)

公开课参与方式:
方式1:扫码填报草料二维码申请,用户可向管理员申请参加,前100名可直接进入会议室参与讨论、学习,报名后接收管理员私发会议链接(腾讯会议),会议链接如下:
会议主题:DFTC发酵大会:菌种开发过程中的高通量筛选技术(01)
会议时间:2024/08/28 09:00-11:00 (GMT+08:00) 中国标准时间 - 北京
该会议开启了报名功能,请点击链接报名后入会:
https://meeting.tencent.com/dm/xXXZS0duffNE
#腾讯会议:434-881-022
复制该信息,打开手机腾讯会议即可参与
方式2:扫码下文微信群二维码,进入发酵大师平台下属本专题技术群,平台会在临近会期前保持通知状态,防止用户忘记本次学习机会;
方式3:用户关注视频号【酵脑风暴】,及时观看直播教学;
方式4:可持续关注【发酵大师】公众号,会议直播期间可由公众号跳转至视频号观看直播并提问交流。

课程预约可扫草料二维码填报信息


预约通知可进群接收,本群会后会长期保留

发酵大师网
本公众号隶属发酵大师网站 www.microbeee.com,登录发酵大师可享受更多技术板块服务!发酵大师网的最大特点是干货分享,通过对各发酵细分领域及工段的技术分析,发酵从业者可快速解决问题,适用于大学生、研究生、科研人员、企业工程师等
 最新文章