CRISPR/Cas9介导的高效四倍体马铃薯试管薯基因编辑体系的建立
宋倩娜，段永红，冯瑞云
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0536
绝大多数的栽培马铃薯为四倍体，常规传统育种周期长、效率低。基因工程加快了马铃薯的育种进程，但无法实现基因的定向修饰。基因编辑技术是一种精准的分子育种手段。近年来，基因编辑技术已经发展成为农作物精准育种的重要技术手段。马铃薯基因组测序的完成使得实现其精准分子育种成为了可能。CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因编辑技术，在马铃薯定向遗传改良和精准育种方面发挥了重要的作用。然而马铃薯精准分子育种依赖于遗传转化，尽管马铃薯遗传转化体系相对比较成熟，但是针对不同基因型马铃薯的最适转化条件及转化频率存在较大的差异，极大的限制了基因编辑技术在马铃薯改良中的应用。
马铃薯试管薯作为遗传转化的理想材料，其具有取材方便、不需要预培养、操作简单、不经愈伤化可直接诱导芽再生等优点。但是马铃薯试管薯的形成和发育受多种因素的影响 , 不同基因型的马铃薯对同样培养条件反应存在差异。因此，针对特定品种马铃薯试管薯的诱导需要研究相应的配方。另外，受基因型等因素的影响，马铃薯遗传转化体系存在转化频率较低、重复性不强等问题，尽管人们对其遗传转化体系进行了详细的研究，但这些转化体系仍高度依赖基因型。此外，利用抗生素筛选获得的阳性植株，后期需要利用PCR等技术进行再次鉴定来评估转化效率，工作量大。可视化筛选标记基因具有操作便捷、可直接观察等优点，其中绿色荧光蛋白（GFP）报告基因在植物遗传转化效率评估中有着广泛的应用。
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本文主要包括以下几部分内容：
2.1 蔗糖浓度对马铃薯试管薯诱导的影响
2.2 植物激素对马铃薯试管薯诱导的影响
2.3 不同部位茎段长度对马铃薯试管薯诱导的影响
2.4 StuPPO2基因敲除载体的构建及试管薯的遗传转化
2.5 StuPPO2基因阳性植株的筛选及敲除突变体的检测
2.6 试管薯基因编辑体系在其它四倍体马铃薯中的测试
3 讨论
遗传转化过程中的再生难、转化频率低是制约马铃薯基因编辑育种的主要瓶颈。尽管众多研究学者对马铃薯遗传转化过程中的外植体种类、抗生素种类及浓度等多种因素进行了优化，但对于不同基因型马铃薯而言，再生频率低和转化频率低的问题仍然存在。本研究以试管薯作为外植体，利用2种不同的诱导分化激素配方，采用150 mg/L卡那霉素的选择压，青薯9号和并薯6号的芽分化频率分别为41.5%和44.8%。同时转化CRISPR/Cas9基因编辑载体，利用载体上携带的GFP标记基因再次筛选阳性再生植株，青薯9号和并薯6号的转化频率分别为51.9%和41.3%，其中基因敲除效率分别为82.1%和63.2%。此外，利用筛选到的最适诱导分化激素配比，其它3个不同基因型马铃薯的试管薯均可高效地诱导植株的再生，并实现基因组编辑。
基因编辑技术尤其是CRISPR/Cas9技术已经成为作物改良的重要技术手段，其在水稻、小麦和玉米等重要农作物的定向遗传改良方面已经得到了成功的应用。尽管基因编辑技术在马铃薯定向遗传改良中也得到了成功的应用，但尚为有限。遗传转化是马铃薯基因编辑成功应用的一个必须的条件。受马铃薯品种的影响，很多马铃薯品种遗传转化体系的建立比较困难，难以获得转基因再生植株。因此，本研究建立的高效的马铃薯试管薯基因编辑技术体系一方面可为马铃薯的遗传转化提供技术支撑，同时也为将来马铃薯的精准分子育种奠定基础。
通过对5个不同基因型四倍体马铃薯的试管薯诱导及其遗传转化再生体系进行摸索，成功建立了高效的马铃薯试管薯遗传转化再生体系，同时以试管薯为受体材料，结合基因编辑载体上的GFP筛选标记基因，建立了CRISPR/Cas9介导的马铃薯试管薯基因编辑技术体系，在其中的4份马铃薯材料中成功实现了基因组编辑，效率最高可达82.1%。
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