童玮婧，罗数，陆新露，沈建福，陆柏益，李开绵，马秋香，张鹏
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0509
木薯（Manihot esculenta Crantz）（2n=36）属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot），在热带和亚热带地区广泛种植，是全球第六大粮食作物。木薯是一种生氰植物，除种子外的其他各器官中均含有两种具有潜在毒性的生氰糖苷（cyanogentic glycosides）——亚麻仁苦苷和百脉根苷。生氰糖苷，又称氰苷或氰醇苷，生氰糖苷的合成主要发生在木薯茎尖以及幼嫩叶片中，随后由韧皮部运送至根部细胞的液泡中贮存。最近的研究发现储藏根中也可以原位合成生氰糖苷。
生氰糖苷储存于液泡中，本身不具有毒性。在植物受损时，生氰糖苷会被释放至细胞质，进一步被β- 葡萄糖苷酶去糖基化形成丙酮氰醇，而丙酮氰醇可在pH>5.0或温度高于35℃时自发水解，或被丙酮氰醇分解的关键酶α- 羟腈酶（α-hydroxynitrilelyase，HNL）转化为有毒的氰化氢（hydrogencyanide，HCN）以及葡萄糖和醛或酮，即发生生氰反应。在食品加工过程中，生成的氰化物随着气体挥发或溶于水中，从而不影响食用。然而捣碎、浸泡、晾晒、烘焙、蒸煮和发酵等传统的处理方法虽然可以对木薯进行脱毒，但会存在清除不彻底的风险，而误食未经过处理或处理不充分的木薯会引起甲状腺功能亢进、呼吸紊乱等病症，甚至威胁生命。因此，培育低毒木薯新品种在生产实践中具有重要意义。
目前生产上使用的木薯分为苦味和甜味两类。由于苦味木薯抗病虫害的能力较强，在生产中多被使用。但苦味木薯往往含有较高水平的生氰糖苷，容易造成食用安全的隐患。通过传统育种方式可以进行低毒木薯的选育，但特别耗时费力，而利用生物技术手段可以大大缩短育种周期，其策略主要包括两种途径：一是从源头上抑制叶片中生氰糖苷的合成；二是加快氰醇化合物的转化降低生氰糖苷的含量。CRISPR/Cas9技术已被用于改善木薯储藏根淀粉品质、提高抗病和抗细菌能力、降低木薯毒性等方面。然而，目前尚未见报道利用编辑技术对HNL进行的相关研究。
本文现已在知网上线，欢迎下载阅读！
本文主要包括以下几部分内容：
2.1 编辑位点选定以及CRISPR/Cas9载体的构建
2.2 突变体植株鉴定
2.3 编辑效率及类型分析
2.4 突变体材料氢氰酸含量检测
2.5 突变体材料生氰糖苷含量检测
3 讨论
生氰糖苷是木薯中氰化物的主要形式，早期研究认为生氰糖苷主要是在木薯叶片中合成，然后转运至储藏根中贮存。最近的韧皮部环割实验结果暗示了根部可能也进行了生氰糖苷的合成。生氰糖苷的合成和降解途径已研究得比较清楚，HNL是生氰糖苷降解的关键酶，其定位可能也与合成途径中的这些基因有关。
通过干扰或编辑生氰糖苷合成途径的关键酶可以抑制生氰糖苷的合成。通过加速根中生氰糖苷的分解也可以降低木薯中氰化物的含量。HNL作为进一步将丙酮氰醇降解为挥发性氰化物的关键酶，其酶活性的高低是丙酮氰醇能否被完全降解的关键因素。但是HNL在木薯根中的转录表达水平较低，仅为叶片中的6%，且检测不到蛋白的表达和活性，因此通过增加HNL在根中的表达有望降低木薯的毒性。本研究通过编辑HNL基因抑制其表达，显著降低了叶中生氰糖苷和HCN的含量。推测本研究可能与HNL的表达受抑制导致氰醇的降解受阻，造成对生氰糖苷的反馈抑制有关，其具体机制需要进一步研究。
生氰糖苷的变化对木薯的生长发育及表型也会产生影响。本研究中MeHNL编辑植株的叶片在组培苗和盆栽苗中均出现细长的变异表型。目前有研究认为生氰糖苷对木薯生长发育表型的影响可能与激素的调控及氮同化有关。在缺乏还原态氮条件下，反义抑制CYP79D1/D2植株叶片亚麻仁苦苷向根部的转运受阻，抑制了木薯根的生长，在培养基中补充氮可以恢复其生长。基于MeHNL突变体异常的表型，后续将进一步对突变体中的各种氨基酸和激素含量进行分析，以研究MeHNL在木薯生长发育和氮同化中的功能。
利用CRISPR/Cas9技术编辑木薯MeHNL基因，通过农杆菌介导的稳定转化获得27株阳性植株，编辑效率高达96.3%。突变体植株叶片中氢氰酸和生氰糖苷含量均显著降低，叶片出现细长的异常表型，表明MeHNL不仅调控木薯的生氰代谢，还影响其生长发育。
推荐阅读：
薯类作物生物技术专题 | CRISPR/Cas9介导的高效四倍体马铃薯试管薯基因编辑体系的建立
欢迎订阅：
1. 各地邮局订阅：邮发代号18-92
2. 科学出版社期刊发行部：电话 010-64017032；010-64017539
3. 网上购买：扫描下方二维码或在淘宝、微店搜店铺名称“中科期刊”可直接订阅
投稿、转载信息发布及合作等事宜请联系:010-82109925/82109903
官方唯一投稿系统：http://biotech.aiijournal.com
长按关注：生物技术通报
