![]()
蛋白质靶向降解（Targeted Protein
Degradation, TPD）技术作为一种新兴的药物开发策略，通过小分子化合物诱导E3泛素连接酶与靶蛋白相互作用，从而实现靶蛋白的选择性降解，这种机制使分子胶能够靶向“不可成药”的蛋白质，为疾病治疗带来新机遇。近年来，分子胶（Molecular Glues）作为新一代单价小分子降解剂，因其结构紧凑、药代动力学性质优良逐渐引起研究者们的关注。不过，大多数已知的分子胶是通过偶然发现或已有药物化合物的改造得到的。这种方法依赖于现有化合物的衍生化和实验筛选，缺乏系统性和可预测性。这导致分子胶发现过程中的偶然性较大，难以对未知靶标进行精准设计和筛选。针对传统方法的局限性，斯坦福大学Nathanael S.
Gray和哈佛医学院Eric S. Fischer教授团队提出了一种基于多组分反应（Multicomponent Reactions, MCR）的策略，通过Groebke-Blackburn-Bienaymé (GBB) 反应，进行系统化的化学空间探索，实现了对潜在靶标蛋白（如WEE1、CK1α）的高效筛选和发现。近日，该项研究工作发表在美国化学会出版的Journal of the
American Chemical Society的杂志上（J. Am. Chem. Soc.2024,DOI:10.1021/jacs.4c06127）【1】。该论文作者通过Groebke-Blackburn-Bienaymé (GBB) 多组分反应，合成了一系列包含戊二酰亚胺（glutarimide）结构的化合物库。GBB反应是一种高效的一锅法反应，利用简单的前体分子（如戊二酰亚胺前体、胺和异腈），仅通过一步合成即可生成结构多样的化合物。通过这种方法，研究人员合成了超过200种化合物，显著扩展了可筛选的化学空间。随后，该论文作者在急性淋巴白血病细胞系MOLT-4中进行细胞增殖抑制实验，筛选出了能够显著抑制细胞增殖的候选分子。具体流程如图1所示。图 1 扩大CRBN分子胶降解剂的化学空间发现及筛选流程。在靶点验证实验中，该论文作者通过标签自由定量蛋白质组学，识别出CK1α和WEE1为主要的降解靶标。实验数据显示，化合物2（HRZ-1衍生物）在CRBN野生型细胞中的EC50值低至5 nM，而在CRBN敲除细胞中几乎无活性，表现出强效的CRBN依赖性降解效果。结果如图2所示。图 2 WEE1和CK1α被化合物1−3以依赖于CRBN E3连接酶的方式降解。
接下来，该论文作者利用GBB反应合成的优势，对HRZ-1的化学结构进行了多种修饰，以分析其构效关系。通过改变HRZ-1结构中的异氰基、氨基和芳基等取代基，研究者发现芳基上的疏水取代基（如化合物10中的三环己基团）能够显著增强对WEE1和CK1α的降解能力，其DC50值低于2 nM，展现出极高的降解效率。另外，替换异吲哚酮核心为邻苯二甲酰亚胺，会显著削弱CK1α的降解效应，而对WEE1的选择性降解效果不变。这表明异吲哚酮核心结构在WEE1选择性降解中起到了关键作用。为进一步验证分子的作用机制，该论文作者首先通过TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)实验检测了WEE1、CRBN与化合物10之间的相互作用。实验结果显示，当加入化合物10时，TR-FRET信号显著增强，表明WEE1与CRBN成功形成了稳定的三元复合物，进一步支持了分子胶的作用机制。随后，该论文作者利用冷冻电镜（Cryo-EM）解析了CRBN-WEE1-化合物10三元复合物的结构。结果发现，WEE1激酶的G-loop区域（特别是Gly322残基）在化合物10与CRBN结合中发挥了关键作用。通过突变实验验证，Gly322突变为Asn完全阻止了WEE1的降解，证明该甘氨酸是分子胶结合的核心位点。与之前报道的CK1α分子胶不同，WEE1的G-loop区域疏水氨基酸是化合物10的重要结合位点，使得化合物10对WEE1有较好的选择性。图 3 化合物10、WEE1和CRBN三元复合的结构表征。
最后，作者验证了其开发的分子胶降解剂在多种肿瘤细胞系中对WEE1和CK1α蛋白的降解效果，结果如图4所示。化合物1和化合物10表现出强效的抗增殖效果，尤其在MOLT-4和MOLM-14等血液肿瘤细胞系中，其细胞增殖抑制效果优于对照组WEE1 PROTAC（如ZNL-02-096）。化合物6和13作为WEE1的选择性降解剂，虽然在大部分细胞系中抗增殖效果不是很出色，但与化疗药物（如Gemcitabine）联合使用存在潜在的协同效应。图 4 HRZ-1 骨架分子胶在不同细胞上降解效果测试。
小结：该论文作者报道了一种新颖且高效的策略。利用多组分反应（MCR）构建多样化的小分子库，并结合无标签定量蛋白质组学筛选潜在靶标，实现快速识别和发现新型分子胶降解剂。这一策略不仅简化了分子胶的开发流程，还为后续更广泛的分子胶降解剂的设计和应用提供了坚实的基础。
参考文献
【1】Hlib
Razumkov, Zixuan Jiang, Kheewoong Baek, Inchul You, Qixiang Geng, Katherine A.
Donovan,Michelle T. Tang, Rebecca J. Metivier, Nada Mageed, Pooreum Seo,
Zhengnian Li, Woong Sub Byun,Stephen M. Hinshaw, Roman C. Sarott, Eric S.
Fischer,* and Nathanael S. Gray*.Discovery
of CRBN-dependent WEE1 molecular glue degraders from a multicomponent
combinatorial library. J. Am. Chem. Soc. 2024, ASAP,
DOI: 10.1021/jacs.4c06127
