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三阴性乳腺癌（TNBC）是一类具有高侵袭性和高度异质性的恶性肿瘤，约占乳腺癌患者的15-20%。常规放疗和化疗对于TNBC的疗效有限，且耐药性问题使得治疗难度加大。目前，多靶点疗法逐渐显示出在TNBC治疗中的潜力，特别是靶向Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的双重抑制策略。因此，针对ROCK
- HDAC的双靶向治疗策略成为新的研究方向，以期进一步提高治疗效果并克服耐药性。近期，浙江大学马忠俊教授团队设计出一种新颖的双靶向小分子抑制剂（化合物10h），可以有效抑制ROCK-HDAC活性，并在体内外实验中表现出显著的抗肿瘤效果，为TNBC的抗肿瘤免疫治疗提供了全新思路。近日，该研究工作发表在美国化学会出版的药物化学核心期刊Journal
of Medicinal Chemistry【1】。论文作者通过多阶段的虚拟筛选，结合了ROCK和HDAC两个蛋白的药效团模型，首先从数千种分子中挑选出具有潜力的双靶向候选分子：保留与ROCK2的Lys121和Met172残基形成氢键的药效团，再引入合适的HDAC抑制剂连接体和药效团，构建ROCK/
HDAC双靶点抑制剂。并利用分子对接筛选出能够与ROCK2和HDAC同时形成稳定结合的分子。团队进一步将筛选所得分子依照ROCK和HDAC的抑制效果进行结构优化，最终获得了活性和选择性俱佳的先导化合物10h。在该项工作中，论文作者利用Thioquinomycin
A的分子结构为起点，通过药效团迁移策略，结合了ROCK2和HDAC1/6的活性抑制基团，并对化合物进行一系列结构改造，最终合成了具有良好药物属性的化合物10h。在分子动力学模拟中，化合物10h的羟肟酸基团与HDAC的锌离子双齿结合，同时其苯并噻吩部分能够有效嵌入ROCK2的ATP结合口袋，显著提高了与ROCK和HDAC的相互作用。这些相互作用共同促成了化合物10h与靶蛋白之间的结合稳定性和良好的相互作用。![]()
图1.化合物10h结合模式预测
论文作者利用Western
blot检测发现，10h能够在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中显著降低ROCK和HDAC的蛋白水平，且这种抑制作用随浓度增加而增强。为进一步确认抑制机制，论文作者加入蛋白酶体抑制剂，发现10h的作用机制不依赖于蛋白质降解，而是通过直接抑制ROCK-HDAC蛋白活性来实现。![]()
图2.化合物10h（1和10 μM）处理24 小时的MDA-MB-231 细胞中CRT 和HMGB1 的表达水平显著降低
人乳腺癌细胞系和4T1 小鼠乳腺癌细胞系中的抗肿瘤活性。10h在两种细胞系中均表现出比阳性对照更强的细胞毒性，表现出低浓度即显著抑制细胞增殖的效果，IC50值分别为0.37 ±0.01 μM和0.73 ±0.03 μM。10h表现出低浓度即显著抑制细胞增殖的效果。此外，流式细胞术显示10h能够阻止癌细胞进入G2/M期，从而有效地诱导细胞凋亡。为了验证化合物10h在体内的抗肿瘤效果，论文作者在小鼠乳腺癌移植瘤模型中进行了实验，分组包括10h处理组、HDAC抑制剂对照组和ROCK抑制剂对照组。结果表明，10h处理组小鼠的肿瘤体积显著减小，且在试验期间无明显毒性反应。经免疫组织化学分析发现，10h组小鼠的肿瘤组织中ROCK和HDAC的表达显著减少，同时肿瘤浸润的CD8+
T细胞数量显著增加，表明10h能够诱导有效的抗肿瘤免疫反应。![]()
图3. 4T1原位小鼠模型中，雌性Balb/c小鼠连续15天口服对照组、SAHA（50mg/kg）、10h组（50mg/kg）和（25mg/kg）进行体内抗肿瘤治疗效果研究
小结
该项研究首次提出了ROCK和HDAC双靶向抑制剂的概念，并通过化合物10h展示了其在抑制TNBC细胞增殖、诱导免疫应答和提高肿瘤抑制方面的潜力。化合物10h在体内外均展现出良好的抗肿瘤活性，显示出较高的ROCK和HDAC抑制效果。体内试验证实化合物10h能够有效抑制肿瘤生长且无显著毒性反应，为未来三阴性乳腺癌的临床治疗提供了新选择。参考文献
【1】Mao
C, Fang J, Zou S, Huang Y, Chen X, Ding X, Fang Z, Zhang N, Lou Y, Chen Z, Ding
W, Ma Z. Discovery of the First-in-Class Dual-Target ROCK/HDAC Inhibitor with
Potent Antitumor Efficacy in Vivo That Trigger Antitumor Immunity. Journal of
Medicinal Chemistry , Article ASAP, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.4c02183
