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CRM1（染色体区域维持1，也称为exportin 1或XPO1）,在调控肿瘤抑制蛋白（TSPs）、生长调节蛋白（GRPs）和抗凋亡蛋白的核内平衡中扮演着关键角色。CRM1在核转运过程中的功能失调，与多种癌症（例如结肠癌等）以及自身免疫性疾病的发生密切相关。因此，CRM1被视为治疗人类癌症和炎症性疾病的一个极具潜力的药物靶点。近日，浙江大学侯廷军课题组结合自定义基于结构的虚拟筛选技术和生物学评估方法，成功发现一种潜在的CRM1拮抗剂AN-988。该项研究工作发表在美国化学会旗下的Journal of
Chemical Information and Modeling期刊上【1】。CRM1是一种由21个串联的HEAT重复序列组成的蛋白，这些重复序列形成了一个环状结构，其中NES位点对于CRM1介导的蛋白质核输出是必需的。作者设计了一套虚拟筛选流程，旨在通过靶向NEB位点识别潜在的CRM1抑制剂。作者首先从文献中收集37种已知的CRM1共价抑制剂，并从Michael受体库中随机挑选了1000个分子，共同构建一个基准测试集。这一测试集的建立是为了评估所采用的对接策略在区分活性化合物与非活性诱饵方面的有效性。研究结果显示，Glide SP对接策略在两种晶体结构上（4HAT和4WCF）的富集率相对较低，其AUC值分别为0.667和0.709（图-1）。相比之下，虽然CovDock-VS在分子对接过程中的运行速度稍慢，但它在两种结构上的AUC值分别达到0.844和0.811（图-1），这充分证明CovDock-VS策略在提高筛选性能方面的显著优势。基于上述结果，作者计划采用一种分层筛选策略：首先使用非共价的Glide SP进行初筛，快速过滤具有明显不合理结合模式的化合物；随后利用CovDock-VS模块进行共价对接，以进一步筛选潜在的有效抑制剂。这种结合两种对接策略的分层虚拟筛选方法是平衡预测准确性和计算效率的最佳选择。图-1对比不同分子对接策略在两个晶体结构上的筛选性能（ROC曲线分析）（A）PDB编号：4HAT （B）PDB编号:4WVF
随后，作者对Specs化合物库进行虚拟筛选。以CRM1与两种共价抑制剂leptomycin B（PDB编号：4HAT）和KPT276（PDB编号：4WVF）的晶体结构作为分子对接的模型。使用Schrödinger2017软件对两个蛋白结构进行了预处理。接着，以晶体结构中的配体为中心构建对接网格盒子。具体的筛选流程如下：1) 鉴于大多数已知的CRM1共价抑制剂均属于Michael受体类型，作者首先对Specs库中约21万小分子进行过滤，筛选出潜在的Michael受体（~3万），并使用Schrödinger中的LigPrep模块对这些分子进行预处理。2）将准备好的分子通过Glide SP模式对接到两个受体结构中的NES位点，考虑到只有分子的反应基团高度接近亲核Cys539才有可能形成共价键，因此仅保留每个配体的反应性基团与关键残基Cys539距离在5Å以内且打分函数排名最高的结合模式。3）设定对接得分阈值为-5.5 kcal/mol，筛选出在两个对接模型中得分均低于此阈值的分子。这些分子被保留下来，并用于后续的CovDock-VS共价对接，以模拟Michael加成反应。 4）通过Lipinski的五规则过滤不符合标准的化合物。5）聚类分析，最终购买50个候选化合物进行生物学评价。利用生物层干涉法（BLI）进行初步评估，作者测定了50个化合物与CRM1的结合亲合性。结果显示，有30个化合物的结合信号值大于0.01nm(图-2A),其中8个化合物表现出较强的亲合力。值得一提的是，AN-988(编号2)与CRM1的结合常数Kd值达到615nM（图-2C）。随后，进一步评估这8种潜在化合物对HCT116细胞生长的影响（图-2B）。在这些化合物中，AN-988在30uM的浓度下表现出显著的抑制作用，抑制率达到82.17%。![]()
图-2 BLI结合动力学和细胞毒性实验结果 (A)8种化合物的BLI结合动力学曲线；(B)50个化合物对CRM1的BLI响应值；(C) 8种候选化合物对结肠癌细胞系生长的抑制率；(D) AN-988与CRM1相互作用的BLI结合动力学曲线；(E) AN-988的化学结构。
通过CovDock-VS对接技术，作者确定了CRM1与AN-988的结合模式，并据此进行了长达100ns的分子动力学模拟。模拟结果揭示，CRM1的NES位点中Cys539硫原子与AN-988形成了共价键。同时，分析分子动力学轨迹发现，CRM1和AN-988的主链Cα原子在整个模拟过程中的RMSD值保持稳定（图-3C），这显示了它们之间结合的稳定性。进一步的均方根波动（RMSF）分析表明，在CRM1的结合口袋区域内（残基编号：520-600），未观察到显著的波动（图-3D）。这些结果表明AN-988能够在CRM1的NES位点形成稳定的结合模式（图-3A）。图-3 AN-988与CRM1的预测结合模式和MD稳定性分析（A）AN-988与NES口袋的相互作用图；（B）电势能表面分子结合模式；（C）AN-988与周围残基的相互作用（C）RMSD分析图；(D)RMSF分析图。在进一步研究中，作者通过Western blot实验验证了AN-988对CRM1表达的抑制作用，实验结果显示，AN-988能够以剂量依赖性的方式有效抑制CRM1的表达（图-4A）。此外，利用共聚焦显微镜免疫荧光技术，观察到AN-988在3小时处理后，能够促进Foxo3a蛋白在细胞核内的积累并呈现剂量依赖性（图-4B、C）。同时，作者还发现经AN-988处理后，促炎和增殖相关的蛋白Bcl-XL和caspase-3的表达水平下调，促凋亡蛋白BAX表达则显著上调并呈现剂量依赖性（图-4E），周期相关蛋白cyclin D1的表达显著下调，而p27和p21则上调（图-4F）。此外，AN-988处理还导致HCT-116细胞中pAKT蛋白表达的下调（图-4D）。综合这些发现，AN-988通过促进Foxo3a在细胞核内的积累，有效阻滞AKT信号通路，抑制结肠癌细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞，并激活了凋亡过程。![]()
图-4 AN-988抑制CRM1引起FOXO3A的核保留实验数据（A）AN-988处理后的CRM1蛋白水平（B）共聚焦显微镜测定Foxo3a的核保留（C）每个细胞荧光强度定量Foxo3a核比值（D）AKT和p-AKT的代表性Western blot结果（E）Western blots显示凋亡相关蛋白的蛋白水平 (F)周期相关蛋白的表达谱 (G) AN-988的潜在作用机制
在本工作中，作者报道一套自定义基于特定结构的虚拟筛选流程，并成功筛选出一系列潜在活性的化合物，随后，通过一系列生物学实验AN-988在治疗肠道炎症和肿瘤方面的作用进行了全面评估。AN-988的发现不仅为新型共价抑制剂的研发提供了通用计算方法，而且为炎症相关肿瘤的治疗带来了一种有前景的临床前候选药物。参考文献
【1】Liu H, Shen C,
Li H, Hou T, Yang Y. Discovery of Potent Covalent CRM1 Inhibitors Via a
Customized Structure-Based Virtual Screening Pipeline and Bioassays. J Chem Inf
Model. 2024 Oct 14;64(19):7422-7431. doi: 10.1021/acs.jcim.4c00913. Epub 2024
Oct 3. PMID: 39361942.
