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大环肽作为配体骨架，凭借其内源多肽的特性展示了天然的高特异性和亲合力，能够精确靶向体内靶标。其环化引入的构象约束使环肽不仅有效靶向深层蛋白质结合口袋，还能识别广泛的蛋白质表面。此外，环肽可以通过多种高通量技术生成大量随机序列并进行结构修饰，从而加速发现与目标靶标高效结合的大环肽或肽模拟物。尽管如此，环肽亲合配体的优化过程与小分子亲合配体有所不同，其中包括氨基酸序列的选择、环肽大小、环化方式及环化位点的确定，以及非天然氨基酸的引入，这些都对大环肽亲合配体的开发构成了挑战。 当前，共价抑制剂的研究已步入第三阶段：从偶然发现和可逆亲合元件的设计，转向优先筛选具有共价弹头的亲电性化合物。因此，能够高通量筛选和鉴定靶标的共价大环肽配体的技术，如噬菌体展示、mRNA展示及DNA编码环肽库筛选，将展现极高的应用潜力。然而，尽管已有环肽药物成功上市并用于疾病治疗，且许多环肽候选药物目前已处于临床试验阶段，但这些药物主要集中在非共价环肽配体上。当前，对共价环肽配体的研究仍相对不足。实际上，针对半胱氨酸残基的共价大环肽骨架有助于发现靶向功能性半胱氨酸的高特异性、低免疫原性的配体。通过生成具有共价弹头的大环肽共价库，并对“难成药”靶点进行基于亲电性共价结合的筛选，将展现出更广阔的应用前景。芝加哥大学Bryan C.
Dickinson 教授课题组针对共价大环肽库的构建及靶标筛选均提出了新的思路，并基于新方法挖掘了TEV蛋白酶最具潜力的共价抑制剂。近日，该项研究工作发表在美国化学会出版的Journal of the
American Chemical Society期刊（J. Am. Chem. Soc. 2024, DOI:
10.1021/jacs.4c07851）【1】。![]()
图1、使用DBA-VS接头进行共价配体选择的mRNA展示平台。
本文关于⼤环肽⽂库的构建流程主要包括如下步骤。首先，转录生成mRNA文库并对其进行修饰，然后通过体外翻译生成相应的复合物。接着，使用逆转录技术将mRNA-复合物转录为cDNA/mRNA-复合物。随后，通过DCA-VS对两个半胱氨酸残基进行共价连接，实现多肽复合物的环化，形成硫醚大环。其中存在几个突出的亮点值得一提：在体外翻译前，研究人员不仅对mRNA文库进行DNA标签修饰，以方便利用磁珠（oligo-dT）进行后续多肽复合物的纯化，同时还设计了荧光基团，以便跟踪翻译产物并通过荧光凝胶检测修饰连接的mRNA。而在多肽环化过程中，作者借用噬菌体共价环肽展示技术中的三官能团试剂连接子——1,3-二氯乙酰基烯基砜（DCA-VS），在环化的同时为环肽引入了亲电共价弹头。最后，作者通过设计了TEV裂解实验来评估mRNA多肽复合物的环化效率，如图1A所示，使环化过程得以量化。研究表明，DCA-VS浓度为 205 μM 时 ，环化达到峰值30 %，继续升⾼其浓度，将会导致不必要的聚合现象出现。在对构建的环肽库的应用中，作者先利用mRNA-硫醚共价大环肽文库C(NNU)9C，对TEV蛋白酶进行了预筛选。经过四轮筛选后，cDNA的回收量先是下降然后又有所增加。比较各轮筛选结果显示，TEV蛋白酶依赖性富集显著发生在第四轮筛选中。从测序数据分析来看，虽然大多数随机区域的结构得以保留，但并未观察到明显的一致性序列富集。相反，大多数富集的序列集中在恒定区域的HA标签（YPYDVPDY），这一现象部分由于突变和HA标签编码序列的提前删除所致。此外，EPLY序列的意外富集表明，在筛选过程中严格的质量控制至关重要。因此，考虑到TEV蛋白酶对EPLY序列的偏好，作者设计了具有更佳密码子覆盖率的文库，以优化筛选效果。如图2A所示，作者用NNK库替代了原有的NNU库，并将随机肽的长度扩展至9、12和15个氨基酸，以提高氨基酸序列的覆盖率（涵盖20种天然氨基酸）和随机肽的长度。在构建文库的体外翻译步骤中，采用了HA标签介导的富集方法替代了oligo-dT纯化步骤，以确保仅保留含有完整HA标签序列的样本。随后，使用包含约5×1012个独特序列的环肽库对TEV蛋白酶进行了筛选，共进行了6轮筛选，直至观察到cDNA回收量的增加。![]()
图2、在TEV蛋白酶上用Cys（NNK）nCys（n=9,12,15）文库进行筛选。
为消除非特异性结合物，研究人员仅选择了Top 20的靶标候选化合物（排除了偏好于阴性对照的结合物），并通过多系列比较，选择了其中5个具有代表性的样本进行重合成和验证，如图2B和图3A所示。在这5个候选序列中，环肽cTEV6-2的富集程度最高。![]()
图3、TEV蛋白酶共价抑制剂的发现。
最后，作者探索了供价键有无对环肽亲合力的影响，如图4所示。研究人员将cTEV6-2中乙烯砜弹头被还原为乙基砜获得环肽ncTEV6-2。在预孵育1小时后，ncTEV6-2的IC50仅为19.45μM（95% CI 14.43-26.93μM），远不如cTEV6-2的IC50为81.7nM（95% CI 65.6-102nM）。这表明共价弹头对于cTEV6-2发挥高效抑制作用是必需的。![]()
图4、CTEV6-2作为TEV蛋白酶的强效共价抑制剂。
小结： 作者开发了一种创新的mRNA展示平台，该平台结合了mRNA环化技术，并利用连接子1,3-二氯乙酰基烯基砜（DCA-VS）实现靶向半胱氨酸的共价修饰。相较于传统方法，DCA-VS作为连接子具有更高的反应性，显著提高了环化效率并减少了副产物的生成，从而在筛选共价抑制剂方面展现了显著优势。此外，研究团队验证了该平台在筛选TEV蛋白酶功能性共价配体方面的高效能力，并筛选出了迄今为止亲合力最强的TEV蛋白酶共价抑制剂cTEV6-2，这一发现突显了该mRNA展示平台在共价抑制剂开发中的有效性。
参考文献
【1】Tong Lan, Cheng Peng, Xiyuan Yao, Rachel Shu Ting Chan, Tongyao
Wei, Anuchit Rupanya,Aleksandar Radakovic, Sijie Wang, Shiyu Chen, Scott
Lovell, Scott A. Snyder, Matthew Bogyo,and Bryan C. Dickinson*. Discovery of
Thioether-Cyclized Macrocyclic Covalent Inhibitors by mRNA Display. J. Am.
Chem. Soc. 2024, https://doi.org/10.1021/jacs.4c07851
