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背景介绍：
蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC) 是一种基于细胞内泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin−Proteasome
System,UPS) 的新兴治疗策略，通常由目标蛋白 (Protein of Interest,POI配体和E3) 泛素连接酶配体组成。它通过促进E3连接酶与POI的相互作用，使POI被泛素化并降解。这一机制为治疗难以靶向的蛋白提供了新机会，已有多种候选药物进入临床试验。然而，E3连接酶的表达差异限制了其在癌症治疗中的效果，且缺乏肿瘤特异性可能导致正常细胞受损，因此亟需开发不依赖内源性E3连接酶的选择性PROTAC药物。目前基于共价自标记标签 (如HaloTag、SNAPTag) 改进PROTAC的方法可实现对多种蛋白的靶向降解，但其主要目的是调节外源蛋白的表达与降解，而非专门靶向降解肿瘤相关蛋白。清华大学李景虹教授研究小组注意到了一种由RNA特异性腺苷脱氨酶 (ADAR) 介导的mRNA碱基编辑策略，据此设计出肿瘤细胞特异性诱导终止密码子UAG的A-to-I碱基编辑，从而激活下游蛋白质的翻译，成功开发出可以在肿瘤细胞中选择性实现靶蛋白高效降解的ClickRNA-PROTAC系统。近日，该项工作发表在美国化学会出版的Journal of the American Chemical Society的期刊（J. Am. Chem. Soc. 2024, DOI: 10.1021/jacs.4c06402）【1】。ClickRNA-PROTAC系统的核心在于运用生物正交化学原理，通过mRNA转染在细胞内表达融合蛋白，该融合蛋白由E3泛素连接酶SIAH1和SNAPTag构成。该系统利用肿瘤特异性mRNA响应的翻译策略，依赖于肿瘤细胞中特有的mRNA序列。当其mRNA通过脂质纳米粒子传递至肿瘤细胞后，5'感应区域与高度表达的特定mRNA互补配对，形成双链RNA结构，激活腺苷酸脱氨酶介导的A-to-I碱基编辑，将UAG终止密码子转换为UIG，从而重新启动3'蛋白编码区的翻译，促成E3-SNAP融合蛋白的表达。在正常细胞中，由于缺乏特异性mRNA，5'感应区域无法形成有效的双链RNA， A-to-I编辑不会被激活，UAG保持不变，从而抑制E3-SNAP融合蛋白的表达，确保系统仅在肿瘤细胞中激活，避免对正常细胞的损害。在肿瘤细胞内，E3-SNAP融合蛋白的表达进一步诱导降解过程。SNAPTag与BG-DBCO小分子共价结合，并通过点击化学反应与含叠氮基团的靶标蛋白配体连接，形成稳定复合体。该复合体能够特异性识别并结合靶标蛋白 (如BRD4) ，通过泛素-蛋白酶体途径促进其降解。在正常细胞中，E3-SNAP融合蛋白未被表达，降解过程不发生，从而保护正常细胞免受损伤。这一选择性机制为癌症治疗提供了更安全和有效的策略，该系统原理如图1所示。![]()
图1 ClickRNA-PROTAC原理。
为了寻找最佳融合蛋白，研究人员筛选了52种不同共价标签的E3泛素连接酶 (Tag-E3) 融合蛋白。结果发现，将SNAPTag与SIAH1的N端融合 (SIAH1-SN) 能够在细胞中高效表达，并有效介导目标蛋白的降解，符合ClickRNA-PROTAC的设计目标。通过生物正交点击化学，研究人员证明了ClickRNA-PROTAC能够通过简单替换弹头分子来降解不同的蛋白质，如BRD4、KRAS和NF-κB，如图2所示。![]()
图2 高效Tag-E3融合蛋白的筛选。
与此同时，作者还优化了叠氮基和POI配体分子之间的链长，以增加最大降解水平(Dmax) 。免疫印迹试验(Western-Blot，WB) 结果表明JQ1-N3-C10 (JQ1-N3分子如图3所示，其中连接子X=10CH2) 是最佳的叠氮共轭配体。在相同条件下，ClickRNA-PROTAC对BRD4的降解呈JQ1-N3-C10剂量依赖趋势。流式细胞术分析显示ClickRNA-PROTAC引起了明显的细胞凋亡。此外，ClickRNA-PROTAC策略在多种细胞系中被证实可以有效降解BRD4蛋白。![]()
图3 ClickRNA-PROTAC的靶向蛋白降解能力和多功能性。
最后，研究人员在肾上腺皮质癌的异种移植小鼠模型上评估了ClickRNA-PROTAC的疗效。将SW-13细胞悬浮液注射进雌性Balb/c裸鼠后，第9天开始给药治疗，每5天一次，共三个周期，监测小鼠健康状态。结果显示，ClickRNA-PROTAC显著抑制肿瘤生长，并且优于传统dBET1 PROTAC。免疫印迹试验分析确认了肿瘤组织中BRD4的降解和细胞凋亡的诱导。肿瘤治疗实验后，苏木精-伊红染色法 (Hematoxylin-Eosin staining,H&E) 染色检查未发现主要脏器（心脏、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏）的组织损伤，表明ClickRNA-PROTAC能够选择性杀伤肿瘤且副作用较小，显示出其在肾上腺皮质癌 (Adrenocortical
Carcinoma，ACC) 临床治疗中的潜力，如图4所示。![]()
图4 ClickRNA-PROTAC在体内治疗肾上腺皮质瘤实验。
小结：在此项工作中，研究人员设计并筛选了能在细胞中良好表达并有效降解POIs的融合蛋白SIAH1-SN，基于此构建了ClickRNA-PROTAC系统。此外，研究还证实了ClickRNA-PROTAC在ACC异种移植小鼠模型中的靶向肿瘤治疗能力。该研究提出的ClickRNA-PROTAC策略，具有不依赖内源性E3连接酶、肿瘤靶向性和可编程性等优势，为PROTAC药物的开发和临床应用提供了新的途径。
参考文献
【1】 Xucong Teng,
Xuan Zhao, Yicong Dai, Xiangdong Zhang, Qiushuang Zhang, Yuncong Wu, Difei Hu,
and Jinghong Li*. ClickRNA-PROTAC for Tumor-Selective Protein Degradation and
Targeted Cancer Therapy. J Am Chem Soc. 2024 Sep 25. doi: 10.1021/jacs.4c06402.
Epub ahead of print. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.4c06402
