前言
实体肿瘤患者的死亡约50%–90%来源于肿瘤的转移，目前临床上也缺乏有效针转移性肿瘤的治疗方法。类似于肿瘤的发生，肿瘤的转移也是一个多步骤的过程，可以将其分为三个主要阶段：播散（dissemination）、隐匿性转移（cryptic metastasis）和转移灶形成（overt metastasis）[1]。先前已有大量研究证明肿瘤细胞状态改变及肿瘤微环境会参与到这些过程，并促使肿瘤转移。特别的，肿瘤细胞会重塑患者的系统免疫，促进肿瘤转移[2]（图1）。这种免疫系统的重塑在肿瘤转移的过程当中涉及到免疫细胞状态的改变、肿瘤微环境免疫细胞组成的改变以及细胞间交流信号的改变。先前的研究多是集中于分析比较肿瘤转移灶和原位肿瘤之间免疫细胞构成的差异，缺少对于多步骤肿瘤转移过程当中免疫细胞是如何发生动态变化和重塑的理解。
为了研究此类问题，来自美国斯坦福大学的Ansuman T. Satpathy教授及其团队利用PyMT和 4T1的转移性乳腺癌模型，分析了在乳腺癌发生肺转移的过程当中，免疫细胞在转移的三个阶段当中是如何变化并参与肿瘤转移灶的形成。结果表明髓系免疫细胞的TLR-NF kB炎症信号激活是转移前肿瘤微环境的形成特点。与原位癌相比，肿瘤转移灶的细胞毒性NK细胞在转移过程表现出动态上升。结合人肿瘤转移组织的单细胞测序，发现这种免疫重塑特点也普遍存在人肿瘤转移灶当中。更进一步的分析发现，免疫细胞间的CCL6和IGF1信号在肺转移当中发挥重要作用，可以作为抑制乳腺癌转移的免疫治疗靶点。相关的研究成果以题为‘The temporal progression of lung immune remodeling during breast cancer metastasis’于2024年6月10日发表在Cancer Cell（IF=48.8）杂志上。有关这篇文章如何分析肿瘤转移前微环境当中免疫系统的动态改变，并找到关键的细胞和信号通路的思路值得大家学习。
全文解读
1. PyMT小鼠肺组织scRNA-seq分析揭示了转移性微环境免疫群体结构动态变化
在这项研究中，作者采用的是PyMT乳腺癌小鼠模型，因其具有完整的免疫系统，与人luminal B 型乳腺癌具有很多相似的基因表达特征。该小鼠在6-8周时即可出现原位癌，在14-16周时即可自发性的发生明显的肺转移，因此可作为研究免疫细胞在乳腺癌转移过程当中动态变化的模型。如图2A，作者利用MULTI-seq[3]技术对小鼠组织进行测序，分离出6-14周的PyMT小鼠和9周大的野生型小鼠（对照）肺组织中的CD45+（在免疫细胞普遍表达的标志物）免疫细胞。对所获得的细胞进行聚类注释获得4种T细胞谱系：CD4+和CD8+T细胞，调节性T细胞（Tregs）和γδT细胞；3种单核细胞亚群：经典单核细胞（cM）、非经典单核细胞（ncM）和中间态单核细胞（intM）；2类型的组织驻留巨噬细胞：间质巨噬细胞（IM）和肺泡巨噬细胞（AM）；4类型的树突状细胞（DCs）：Ccr7+迁移性DC，1型常规DC（cDC1），2型常规DC，以及浆细胞样树突状细胞（pDC）；以及中性粒细胞、NK细胞、B细胞、增殖性和先天淋巴细胞（图2B）。为了确定在转移过程当中显著变化的免疫细胞，作者为了将肿瘤转移这一连续的过程利用差异矩阵Jensen-Shannon 散度(JSD)分割成三个主要的部分：（1）野生型和6-9周龄PyMT小鼠的“转移早期”肺组织；（2）“转移中期”的肺组织来自9-12周龄的PyMT小鼠；（3）“转移晚期”肺组织来自12-14周龄的PyMT小鼠（图2C）。进一步分析发现，经典单核细胞（cM）和中性粒细胞（Neu）随着转移过程增加，而肺泡巨噬细胞（AM）随着转移过程减少（图2D）。
2. 转移前微环境表现出组织驻留性巨噬细胞的TLR-NF kB 炎症信号被激活
先前已有研究大量证明髓系免疫细胞在肿瘤转移过程当中具有重要作用，且可以成为抗转移的治疗靶点。因此，作者进一步对髓系免疫细胞进行分析。所获得的髓系免疫细胞可以简单分为两群：（1）迁移到肺部的骨髓来源的单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞；（2）组织驻留巨噬细胞：间质巨噬细胞（IMs）和肺泡巨噬细胞（AMs）。在IMs当中，通过无监督聚类和差异基因分析，可以获得四种细胞亚型：Mrc1+ IMs，Cd74+抗原呈递IMs，增值性IMs，Crip1+ IMs（表达转移相关基因S100a10和Vim.）（图3A）。Crip1+ IMs，在转移中期显著增加，且与膝盖损伤小鼠当中的Crip1high Cav1+共享多种基因表达（图3B），这可能表明Crip1+ IMs的上升是为了响应PyMT小鼠的肺部损伤。对AMs进行上述相同聚类分析，获得八种细胞亚群（图3C）：（1）已知功能的AMs：抗原呈递、过敏原反应、肺表面活性稳态、干扰素反应和增殖性的Ams；（2）疾病相关亚型：Gpnmb+ Cd63+ AMs（与其他肿瘤肺部转移的巨噬细胞亚型相似）和表达金属硫蛋白的AMs（存在于慢性阻塞性肺疾病当中）。（3）炎症性AMs，表达细胞因子TNF和 CXCL2和炎症小体成分NLRP3和 TLR共受体CD14。CD14+炎症AMs在转移中期肺部富集，而肺表面活性稳态AMs频率降低，表明转移前微环境的形成需要炎症反应的参与（图3D）。
鉴于CD14+炎症AMs与转移前微环境形成具有密切的联系，可能是潜在的抗转移治疗的靶点。因此，利用非负矩阵（NMF）对CD14+炎症AMs进行转录特征提取，结果表明NMF8在CD14+炎症AMs显著富集（图4A）。NMF8也表达CD14、CXCL2和NLRP3（图4B），并且成比例在中期肺部富集（图4C）。GSEA富集分析表明NMF8与肿瘤坏死因子（TNF）信号显著激活（TNF-NF- κB）相关（图4D）。作者进一步探讨了CD14+炎症AMs的炎症信号被激活的原因，结合之前的研究，发现可能与原位肿瘤诱导的活化CD14+MDSC有关（图E-F）。
3. 髓系细胞TLR-NF kB 炎症信号激活与PyMT小鼠的转移前微环境形成相关
接下来，作者集中分析骨髓来源的髓系细胞（BM-derived myeloid lineages）：单核细胞，树突状细胞和中性粒细胞。在单核细胞中，发现ncM 和cM 比例的相互变化，表现出随着转移的进行cM上升和ncM下降（图5A）。在中性粒细胞当中，作者鉴定出不同分化状态的细胞亚群，发现肿瘤转移的发展与未成熟中性粒细胞和过渡态中性粒细胞比例增加相关（图5B）。中后期成熟中性粒细胞特异性表达脱颗粒相关基因（如Igfbp6和Lrg1）和疾病激活相关基因（如，Ifitm1和Tspo）（图5C）。在树突状细胞当中，相比于之前发现了新的干扰素刺激性和增殖性的树突状亚群细胞，这可能与对炎症的反应有关。同时，作者发现cDC1细胞比例在转移发生过程当中进行性下降，pDC细胞比例在转移中期特异性富集，这与先前研究的两种细胞的功能特点相一致。有趣的是，作者还检测到炎症成熟中性粒细胞共表达CD14、CXCL2和NLRP3，也在转移中期显著富集，且与CD14+“激活”的MDSC模块相关，这和在转移中期肺中富集的炎性AMs具有一致性（图5B）。接下来会对这一部分进行详细讨论。
CD14+炎症AMs和中性粒细胞的共同存在引起作者的好奇，这是否意味着其他的髓系细胞也存在类似的功能性细胞。因此，作者对所有的髓系细胞进行NMF分解，发现NMF19与CD 14+炎症AMs和中性粒细胞高度相关。同时，对单核细胞和IMs分析发现NMF19也与炎症和CD14+ 激活MDSC相关（图6A）。同样，CD14+炎症单核细胞和IMs也在转移中期高度富集（图6B），且NMF19和CD14+ 激活MDSC在各种细胞类型中也高度相关（图6C）。NMF19的GSEA富集分析也表现出TNF-NF-κB炎症信号的激活（图6D）。为了验证上述发现，作者利用细胞流式检测小鼠肺组织髓系细胞CD14蛋白的表达丰度，结果证明中性粒细胞、AMs和单核细胞的CD14表达随着肿瘤转移进展逐渐上升（图6E）。为了进一步验证结论，作者在验证队列的PyMT模型小鼠当中分析CD14+ TLR-NF-κB炎症髓系细胞是否与转移前微环境建立相关。如图6F，结果证明这种炎症髓系细胞存在于单核细胞、中性粒细胞、AMs和IMs。炎症性单核细胞和AMs也在转移中期高度富集。
4. 髓系细胞TLR-NF kB 炎症信号在4T1肿瘤负荷小鼠和人乳腺癌组织当中激活
接下来，作者进一步探索髓系细胞TLR-NF-κB 炎症髓系细胞是否在存在于其他肿瘤模型小鼠和人肿瘤转移组织当中。首先，作者建立4T1细胞原位肿瘤移植小鼠模型，4T1肿瘤负荷小鼠与人类的三阴性乳腺癌具有相似的转录图谱，细胞接种2周后即可出现明显肺转移。作者对4T1肿瘤负荷小鼠接种肿瘤细胞后第2, 4, 6, 8, 10, 12, 14和21天，八个时间点收集肺组织（对照组选取2, 8, 14和21天野生型小鼠肺组织）并进行MULTI-seq。经过与PyMT小鼠测序数据相似的分析之后，发现单核细胞、中性粒细胞、AMs、IMs和嗜碱粒细胞也表现出TLR-NF-κB炎症和NMF19富集（图6G）。TLR-NF-κB炎症髓系细胞比例表现出在转移晚期富集。作者进一步检测TLR-NF-κB炎症髓系细胞是否存在于人肿瘤转移灶当中。作者对公共数据库当4个乳腺癌和1个黑色素瘤患者的脑转移灶单细胞测序数据进行分析，得到了两个主要的髓系细胞群体-APOE+转移相关巨噬细胞（MAMs）（类似于肿瘤相关巨噬细胞）和S100A8+MAMs（类似于MDSC）。检测NMF19表达图谱是否存在于这些细胞类型当中，发现NMF19特异性富集于S100A8+MAMs中（图6H）。表明其也参与人肿瘤转移过程。
5. 淋巴细胞也参与PyMT小鼠炎症和免疫抑制性肺转移微环境的形成
淋巴细胞的作用具有背景特异性且受到炎症信号的调控。鉴于之前已经证明炎症信号的重要作用，接下来，作者对淋巴细胞进行分析，探究淋巴细胞在这种炎症信号调控下如何对肿瘤转移发挥作用。在自然杀伤细胞（NK）当中，作者鉴定出免疫调节性、细胞毒性和增值性细胞亚群，并且发现细胞毒性NK细胞比例在转移过程当中逐渐升高（图7A），并且肿瘤转移灶较原位癌具有更高的细胞毒性NK细胞比例。作者利用细胞流式进一步证明了细胞毒性NK细胞的比例随着转移的发展逐渐上升（图7B）。对公共数据库的肺腺癌单细胞数据中的NK细胞进行分析，发现细胞毒性NK细胞比例在转移性淋巴结当中上升，在原位癌当中下降（图7C）。在T细胞当中，发现T细胞分化随着转移发展逐渐增加（图7D）。在B细胞当中，调节性B细胞（Breg）在转移灶当中比例明显升高（图7E）。以上结果表明淋巴细胞响应炎症信号参与转移灶免疫微环境重塑，同时，NK细胞是在小鼠和人肿瘤转移过程当中被特异性调控的细胞群。
6. 细胞通讯网络分析预测转移相关免疫信号模式
上述分析已经证明肿瘤介导的免疫重塑的两个特征：免疫细胞状态变化和群体结构的改变。同时，鉴于免疫细胞之间强相互调控作用，作者进一步分析免疫细胞是如何在肿瘤转移过程当中相互交流协调去重塑免疫微环境。AM、IM和中性粒细胞之间通过CXCL2- CXCR2信号进行交流传导（图7A）。对转移相关的信号通路进行分析，发现IGF1+IMs和IGF1R+中性粒细胞之间的IGF1-IGF1R信号交流仅存在于WT和转移早期（图7B）。IGF1特异性高表达Mrc1+IMs，且在转移过程当中表达逐渐降低（图7C）。之前已有研究发现IGF1R敲除小鼠的肿瘤转移明显受到抑制，表明IM-中性粒细胞间IGF1-IGF1R信号传导可能有助于转移微环境的形成。除了IGF1-IGF1R外，作者还发现CCL6+ AMs, IMs, 中性粒细胞，单核细胞，CCR1+ 中性粒细胞，CCR1+ 单核细胞, DCs, IMs和NK 间通过CCL6-CCR1/2信号进行交流（图7D）。中性粒细胞的CCL6表达随着肿瘤转移进行性下降而AMs的CCL6表达表现出进行性上升（图7E）。CCL6在不同亚型的中性粒细胞中均表现出下降；在几乎所有的AMs表现出上升，这表明CCL6表达的改变并不是因为细胞群体结构改变所导致的（图7F）。鉴于已有研究表明嗜酸性粒细胞的CCL6促进肿瘤转移，因此，以上结果表明CCL6可能是抵抗肿瘤转移的潜在治疗靶点。
小结
本文利用PyMT小鼠和4T1肿瘤负荷小鼠模型，通过MULTI-seq技术，构建了肿瘤转移全过程的免疫细胞图谱。通过单细胞数据分析和细胞聚类及特征提取发现：1. 髓系细胞TLR-NF-κB炎症信号在肿瘤转移过程当中具有核心作用；2.细胞毒性NK细胞在转移过程当中被特异性调节-表现出转移灶内细胞比例上升和原位癌细胞比例下降。人肿瘤转移组织的单细胞测序数据分析进一步确定了髓系细胞TLR-NF-κB炎症信号在肿瘤转移过程当中的普遍性作用以及细胞毒性NK细胞的特异性调节的存在。最后，通过细胞间交流分析确定了在髓系细胞TLR-NF-κB炎症信号当中发挥核心作用的信号通路：IGF1-IGF1R和CCL6-CCR1/2，可能是未来抑制肿瘤转移的潜在免疫治疗分子靶点。
Immugent点评
这篇文章对于乳腺癌肺转移的分析最大的创新点在于对转移全过程的全面揭示，即分析在肿瘤转移全过程当中，免疫细胞是如何发生阶段性改变，重塑转移灶微环境，从而有助于肿瘤细胞的转移。以往的研究多横向比较不同肿瘤组织之间某个特定时期的免疫细胞特点，这并不适用于肿瘤转移这种多步骤连续发生的过程。因此，这种纵向的分析，更能够有效的找寻抑制早期转移的治疗靶点，从而更有效的阻断肿瘤转移。 文章思路清晰，将免疫细胞分为髓系和淋巴系进行分别分析，最终确定TLR-NF-κB炎症髓系细胞在乳腺癌肺转移当中的重要作用，也确定了在其中可能发挥关键的作用的分子机制。 这篇文章也能为我们带来启示-可以探索随肿瘤进展，肿瘤微环境细胞是如何发生相连续的阶段性改变，从而适应肿瘤的发展。重要在于如何将这种连续的全过程分割成合理的不同发展阶段，从而找寻其中核心的作用细胞和特征分子及信号。
当然，本文也有不足之处：
（1）文章没有太深入的机制研究，很多研究结果都是基于相关性，并没有被证实；
（2）文章当中发现的TLR-NF-κB炎症髓系细胞和NK细胞的特异性变化只停留在相关性层面，并没有进一步的实验分析到底如何影响肿瘤的转移。
（3）TLR-NF-κB炎症髓系细胞的产生的原因可以是组织驻留免疫细胞的分化或者来源于循环免疫细胞，这可能需要结合谱系追踪去确定细胞来源。但是鉴于此类细胞在不同转移灶的多种免疫细胞普遍性，小编还是偏向于其来源于循环免疫细胞。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.05.004
参考文献
[1] Quail DF, Joyce JA. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 2013;19(11):1423-1437. doi:10.1038/nm.3394
[2] Ganesh K, Massagué J. Targeting metastatic cancer. Nat Med. 2021;27(1):34-44. doi:10.1038/s41591-020-01195-4
[3] McGinnis CS, Patterson DM, Winkler J, et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nat Methods. 2019;16(7):619-626. doi:10.1038/s41592-019-0433-8
