01
文献背景
标题：Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level
中文标题：单细胞测序揭示肝硬化的细胞和分子基础
期刊：Nature 2019
影响因子：69
DOI：10.1038/s41586-019-1631-3
02
分析路线和结果
方向：肝纤维化治疗
数据来源：GEO数据库 GSE136103
分析方案：
图0 文章的单细胞数据分析方案
该文章通过肝硬化样本和正常肝脏样本单细胞RNA测序，发现了一种新型的与疤痕相关的TREM2+CD9+巨噬细胞亚群，该亚群在肝纤维化中扩展，从循环单核细胞分化，并且具有促纤维化作用。他们还定义了新型ACKR1+和PLVAP+内皮细胞，它们在肝硬化中扩展，在形态构造上受疤痕限制并增强白细胞的转运。新型疤痕相关巨噬细胞，内皮细胞与PDGFRα+胶原生成间充质细胞之间相互作用的多谱系配体-受体模型揭示了包括TNFRSF12A，PDGFR和NOTCH信号传导在内的几种促纤维化途径的疤痕内活性。
单细胞样本数据分析通常需要经过细胞/基因过滤→多样本整合→降维聚类等步骤的初步分析准备，因此在复现文章结果之前，在云平台上同样需要这些步骤的初步分析，让我们现在开始
1.云平台分析前准备
Step1 上传文章样本数据
云平台分析前，我们需要将原文GEO数据库GSE136103编号的单细胞数据下载到本地。通过【资源总览】下【我的数据】中将每个样本的3个标准文件matrix数据文件上传到云平台上。数据上传成功后，会在【我的数据】中看到上传的单细胞数据。
图1.1 通过【资源总览】→【我的数据】→【数据上传】上传文章数据
Step2 在云平台上新建项目
数据上传成功后，需要在【我的项目】下新建一个项目，后续的任何操作和结果都会呈现在该项目中。
图1.2 点击【资源总览】→【我的项目】→【新建项目】构建新项目
Step3 新建分析流程
任何单细胞RNA数据进行细胞注释前均需要进行细胞/基因过滤→多样本整合→降维聚类等步骤对样本数据进行初步分析，用于评估样本的质量，那么我们首先在新建项目下新建一个分析流程“nature复现”，填写流程名称，选择文章中的样本数据，点击开始分析。
图1.3 填写流程名称→选择文章数据→点击开始分析
任务结束后，会展示每个样本的基因数、UMI数、线粒体基因数的小提琴图，可以用于评估样本的数量。
图1.4 每个样本的基因数、UMI数、线粒体基因数的小提琴图
Step4 按细胞/基因数过滤
上步分析完成后，可以获得nFeature_RNA、nCount_RNA和mito_RNA数评估样本质量。进入【过滤】步骤，过滤可分为按基因过滤和按细胞过滤两种，可以选择填写下图中的参数。点击【过滤】。
图1.5 填写过滤参数后，点击过滤，过滤掉不在参数范围内的细胞。
Step5 多样本整合
数据过滤完成后，需要对数据进行多样本整合，去除样本间的批次效应，目前平台支持CCA、Harmony和Merge，其中merge不去除批次效应,CCA整合效果高，但可能出现过校正的结果，Harmony整合效果适中，这里选择Harmony的整合方案，点击【整合】按钮。
图1.5 选择Harmony方法，点击整合，实现多样本的整合
Step6 降维聚类
多样本整合完毕，会通过【聚类】步骤实现细胞聚类。具有相似基因表达模式或其他生物学特性的细胞会被聚集在一起，分辨率越高，细胞类群越多。按照下图中的参数设定，完成后点击聚类。初步分析已完成，跳转到【细胞注释】部分，可开始文章图表内容复现。
图1.6 填写相应的分辨率和PCA维数，点击聚类，实现细胞聚类
2.文章细胞大群分析结果复现
聚类完成后会跳转到细胞注释页面，该界面可以根据每个细胞cluster中表达的marker来判定细胞类型，具体操作步骤如下：
Step1 细胞注释
初步分析完成后会跳转到细胞注释页面，左侧为聚类结果，共聚类到21个cluster。右侧展示每个cluster的top5 marker的气泡图、小提琴图和热图。根据每个cluster的marker基因来定义细胞类型，注释完成后，点击【新建注释】，输入相应的细胞标签完成细胞类型注释。
图2.1 云平台注释各种细胞类型
首先，作者们将健康与肝硬化人体肝脏细胞进行流式细胞分选并进行单细胞测序，构建了人体肝脏非薄壁细胞的单细胞图谱。作者们将该单细胞测序数据库共享，以方便大家对于健康人体与肝硬化肝脏细胞中基因表达差异进行比较。
使用典型的marker对这些群体进行注释，并成功地鉴定了肝脏组织的主要类型，包括T细胞、B细胞、浆细胞和肥大细胞，以及一小部分非免疫细胞(图2.2)，对于细胞类型的umap降维图（按患者和按分组绘图）可以通过云平台的【画图工具】进行绘制和美化,文章图表的复现，大多数依据云平台的【画图工具】模块，后面会展开讲解。
图2.2 云平台复现文献细胞注释结果，结果一致
图2.3 云平台复现各细胞类群marker的热图
图2.4 云平台复现血液和组织样本合并数据
图2.5 云平台复现血液和组织样本T、B、MP 细胞中CXCR4的基因表达水平
图2.6 云平台复现各细胞类群的细胞数量占比饼图
图2.7 云平台复现各样本的细胞数量及其分布
以上呈现的uamp图、基因表达热图、小提琴图、feature plot图以及占比图等均可以使用云平台【画图工具】模块完成。
例如复现按照健康/疾病的样本分组的，选择云平台的【画图工具】模块，选择“分组统计图”，图形类型选择“饼图”，分组因子选择注释好的细胞类型结果，拆分因子选择healthy1,healthy2,healthy3,healthy4,healthy5,cirrhotic1,cirrhotic2,cirrhotic3,cirrhotic4,cirrhotic5的分组，提交即可绘制上述的细胞占比饼图。
3.文章Macrophages细胞亚群分析结果复现
Step1 亚群选择筛选Macrophages（MP）细胞
为了描述SAMacs的功能谱，我们使用自组织图谱可视化了MP亚群中协调表达的基因组我们确定了基因特征定义了SAMacs，并丰富了与组织纤维化相关的本体。这些定义SAMacs的基因包括TREM2、IL1B、SPP1、LGALS3、CCR2和TNFSF12等基因，其中一些已知在纤维化性肝病中调节瘢痕产生肌成纤维细胞的功能。其余的MP亚群由KCs、TMs、cDC1相关细胞类型的已知功能。
文通过云平台复现该部分结果，首先需要通过【亚群选择】模块将MP细胞筛选出来，具体操作步骤如下：
图3.1 点击【亚群选择】→填写MP细胞信息→点击提交→分析完成后点击+开始从头分析
注：该步骤相当把MP细胞筛选出来重新从质控分析，后续所有分析结果都基于MP细胞
Step2 MP细胞细胞亚群注释
通过TSNE降维聚类注释MP细胞亚群群，包括MP1-MP9，cycling(Fig2a)等。这些标记还TM、SAMac、KC、cDC细胞等(Fig2e)。
图3.2 云平台复现MP细胞的注释结果
Step3 亚群选择筛选Mesenchyme（SAMes）细胞
对人肝间充质细胞的聚类鉴定出了4个群体。Mes (1)簇通过MYH11表达，鉴定为血管平滑肌细胞（VSMCs）。Mes (4)显示了间皮标记物的表达。集群Mes (2)表达高水平的RGS5，RGS5染色确定该群体为hsc。纤维化生态位中RGS5+细胞缺失。簇Mes(3)表达高水平的纤维胶原和促纤维生成基因。PDGFRα+细胞在肝硬化中扩增，并被定位到纤维化生态位，使其被注释为瘢痕相关的间充质细胞（SAMes）细胞。
Step4 纤维化生态位中的多谱系相互作用组
在确定了疤痕相关巨噬细胞、内皮细胞和间充质细胞的群体后，我们证实了这些细胞在纤维化生态位内的密切地形关联，并使用CellPhoneDB在这些群体之间进行了无偏倚的配体-受体相互作用分析。
云平台可以通过【高级分析】模块对巨噬细胞和间充质细胞选择，计算受配体分析。
图3.4受配体分析流程
图3.5巨噬细胞与间充质细胞受配体对分析
在对肝脏纤维化的单细胞测序结果进行聚类分析后，研究发现纤维化肝脏中的TREM2+CD9+标记的巨噬细胞（SAMac(1)和SAMac(2)）数量显著增加。这些SAMac巨噬细胞具有单核白细胞和Kupffer细胞的双重特征。前人的研究表明，巨噬细胞在肝脏纤维化中既可以促进也可以抑制纤维化进程。在小鼠模型中，局部细胞增殖在巨噬细胞数量增加的过程中起着关键作用。此外，增加的SAMac巨噬细胞来源于单核细胞，并在纤维化微环境中显示出终末分化的状态。小鼠模型验证了SAMac的存在在不同物种间的保守性，并且它们在肝脏疾病进展中具有预纤维化的特征。
此外，小鼠模型中显示肝脏内皮细胞参与了纤维化过程。对人类肝脏进行单细胞测序后，肝脏内皮细胞被分为7类，其中两类在纤维化肝脏中的数量显著增加。肝脏间叶细胞被分为4类，其中PDGFRα+间叶细胞在纤维化肝脏中的数量也显著增加。
在对瘢痕化区域的巨噬细胞、内皮细胞和间叶细胞进行分类和定义后，研究人员进行了配体-受体相互作用分析。结果发现，SAMac巨噬细胞通过促进造血干细胞中的纤维胶原表达发挥作用，并且SAMac中表达的EGFR配体已知能够调节间叶细胞的激活。进一步分析还发现，TNFRSF12A、PDGFRA和Notch信号通路在人类肝脏纤维化微环境中作为间叶细胞的调节因子，发挥了重要作用。
Nature中个性化分析通过我们云平台即可复现，并且结果相对吻合，结论一致，由此可见云平台自动化适合新手上路。不会代码又如何，一样可以把数据分析的美图一键搞定！
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寻因生物于2018年成立，历时6年，已完成覆盖单细胞仪器、实验、建库、分析全链条自研产品20余项，提供单细胞科研全周期服务&特殊样本解决方案50余种。
专注单细胞表达谱功能的单细胞3’转录组产品及助力免疫方向研究的单细胞免疫组产品，已实现与国际性能比肩。继而创新推出了真·单细胞分辨率的单细胞空间转录组；实现突变、可变剪切、lnc等更多信息更多物种信息检出的单细胞全序列转录组以及实现FFPE样本更长RNA覆盖的单细胞FFPE转录组等创新技术，从而覆盖肿瘤、免疫、感染、疾病发生发展和发育分化等研究方向。
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