前言
依据不同患者肿瘤的分子特征，可以通过转录组测序数据对肿瘤患者进行分型，这也是如今实现肿瘤精准有效治疗的基础。目前，基于基因分子的表达一致性（consensus molecular subtypes, CMS），利用转录组学数据及单细胞测序数据分析即可以实现结直肠癌(colorectal cancer ,CRC)的亚型分类。这种分类方法虽然可以将CRC分成具有不同特点的亚型类别（iCMS1-4），但是无法有效解决部分类别之间的高度相似性。此外，这种利用CMS进行分类的CRC也存在分型类别和临床CRC肿瘤的表现不相匹配的问题。
为解决上述科学问题,来自英国女王大学Patrick G Johnston 癌症研究中心的Philip D Dunne教授及其团队提出利用信号通路对CRC进行亚型分类。经过对多个队列的CRC患者的转录组学数据和单细胞测序数据进行分析，提出可以将CRC依据信号通路特点分为三种亚型：PDS 1-3(pathway-derived subtypes, PDS)，对这三种亚型的CRC的病理及分子学特点进行了详细的研究和阐述。对比先前已有的CRC分类标准，PDS1-3能够很好的区分具有不同特点的CRC，且与肿瘤细胞的生物学表型相一致。此外，PDS分类鉴定出以往CMS无法区分的PDS3亚型，能够很好地弥补CMS分类存在的问题，这提供了对CRC分类的新见解，为患者的精准治疗提供了基础。
相关研究成果以题为‘Pathway level subtyping identifies a slow-cycling biological phenotype associated with poor clinical outcomes in colorectal cancer’于2024年5月发表在国际著名期刊Nature Genetics (IF: 31.7)。
全文解读
1. 信号通路分析确定CRC的PDS分类
作者首先对FOCUS临床实验当中的360个CRC肿瘤样本，利用ssGSEA算法对MSigDB包中BIOCARTA, PID, KEGG 和 REACTOME 包含的1783个信号通路进行打分。随后选择具有KRAS突变的165个样本进行无监督聚类分析，获得了三个不同的PDS: PDS1 (占样本27%), PDS2 (占样本38%) and PDS3 (占样本35%)（图1a）。对三个PDS的突变图谱进行分析，发现PDS的KRAS突变最为显著（图1b），且各个PDS之间具有相似的突变图谱（图1c）。选取与PDS分类最相关的626个基因作为基因集，对PDS及CMS分类进行分析，鉴定出不同类别的转录分子水平的特点（图1d）。作者发现CMS1和CMS4与PDS2具有相似性，而CMS2和CMS3则是分布在PDS1和PDS3当中（图1f-e）。利用Hallmark collection对PDS进行肿瘤相关通路富集分析，发现PDS1细胞周期相关的信号显著激活，PDS2则表现为上皮间充质转化和炎症信号显著激活，PDS3的KRAS相关肿瘤信号通路显著被抑制（图1g）。上述PDS组别之间分子表达和信号通路的显著差异，是PDS能够成为CRC的分型依据的基础。
为了进一步验证PDS的合理性，作者利用以上626个显著差异基因进行对训练集和验证集进行分析建立预测模型（图1h）。最终选取支持向量机模型(svmRBF)，并将所预测类别依据阈值0.6分为混合（mixed）及PDS1-3（图1i-j）。
2. PDS1-3肿瘤的基因组突变和转录组图谱
接下来，作者利用建立的模型对FOCUS临床实验当中的360个肿瘤样本进行分类（图2a）。分析FOCUS肿瘤样本当中PDS和CMS之间的关系，发现与之前相一致，CMS1和CMS4与PDS2具有相似性，而CMS2和CMS3则是分布在PDS1和PDS3当中（图2b-d）。与此相一致的是，PDS2与PDS1/PDS3相比具有更多的BRAF突变，较少的APC突变；PDS1和PDS3在突变基因上具有相似性（图2e）。基因拷贝分析也的到相同的结果（图2f）。以上结果说明，PDS分类不仅适用于KRAS突变的CRC，也适用于所有其他类型的CRC。
作者利用Hallmark 和DoRothEA对全FOCUS临床样本、GSE39582 (n = 566)以及来自S:CORT项目的人群队列 (SPINAL cohort, GSE248381;n = 258)进行分，确定了PDS分类的转录分子水平特点。结果发现，PDS分型表现在转录水平具有显著差异，具体表现为PDS1细胞周期相关通路激活，PDS2基质和炎症相关信号通路激活，而PDS3则是KRAS突变信号抑制（图2g-h）。这些转录水平的信号通路状态改变也体现在转录因子（TF）的表达活性上，PDS1的E2F显著激活（细胞周期相关TF），PDS2 的SMAD3、STAT3、IRF1 和 ERG显著激活（基质和炎症相关TF），而PDS3的FOXA2 和NR2F2显著激活（激素和发育过程相关TF）（图2i）。进一步检测PDS分型与临床的相关性，作者分析了不同PDS组别间无复发生存期（relapse-free survival，RFS)差异，发现PDS2、PDS3与PDS1相比，具有更差的预后（图2j）。鉴于先前PDS1和PDS3主要富集于CMS2，对CMS2按照PDS进行进一步细分，发现PDS3/ CMS2预后比PDS1/CMS2差（图2j）。这些结果表明PDS分类对于指导CRC患者预后是有临床意义的，且PDS分类能够进一步细化CMS分类。
3. PDS分型的肿瘤内异质性
接下来，作者探索了是何种细胞发生了这种信号通路改变，作者分析了显微解剖肿瘤组织芯片(GSE31279)中的基因表达得分，发现PDS1/PDS2的相关分子通路信号分别来自上皮和基质区，PDS3则在上皮和基质当中普遍分布（图3a,b）。利用来自FOCUS 和SPINAL的组织切片，作者探索了PDS分型和肿瘤组织学特点的相关性（图3c）。结果发现PDS1和PDS2能够很好的在组织学上进行区分（图3d,e），而PDS3则在组织学上无法有效地与PDS1/PDS2区分开（图3d,f）。PDS分型的ESTIMATE评分也发现PDS的免疫和基质评分均位于PDS1/PDS2之间，这与组织学上PDS3表现的混合形态相一致（图3g），导致了PDS3在组织学上难以区分。即使将PDS分型的阈值上调至0.8，使得PDS在转录水平上差异性更加显著，PDS3在组织学上依旧无法区分（图3h-l）。以上结果表明PDS1和PDS2通路信号改变主要来自肿瘤组织的上皮和基质，但是PDS分类能在转录组水平上对CRC患者进行很好的区分。
4. PDS3不具备典型的LGR5+ 和再生ANXA1+ 干细胞样特性
鉴于PDS3特异性组织形态学的缺失，作者进一步分析PDS3与干细胞和肿瘤前体细胞的联系。利用肠道干细胞（ISC）指数对PDS1-3进行ssGSEA评分，结果发现PDS1肿瘤具备LGR5 +隐窝基柱状细胞（CBC）特征，PDS2 肿瘤具备 LGR5−/ANXA1+ 再生干细胞（RSC）特征，而PDS3 肿瘤的则不具备这两种干细胞特征（图4a）。荧光原位杂交实验也证实PDS1肿瘤高表达LGR5，PDS2 肿瘤高表达ANXA1+，而PDS3两种分子表达缺失（图4b）。与癌前病变（息肉）相关性的分析发现，管状绒毛状腺瘤主要与PDS1相似，无蒂锯齿状病变与 PDS2 相关，PDS3缺乏与肿瘤前体病变的关联（图4c）。转录组水平的增殖特征和复制应激指数分析及Ki67+ 免疫组化结果进一步突出了PDS1 肿瘤的增殖特征，而PDS3 肿瘤中缺乏此种特征（图4d,e）。以上结果表明PDS1肿瘤具有干细胞增殖样特性，而PDS3肿瘤的相关特性缺失。为了弥补PDS3无法被特异性区分这一缺陷，作者开发了‘SubtypeExploreR’平台，允许用户对CRC采用现有的多种分型，为CRC患者的分类提供更多的指导（图4f）。
5. PDS1,PDS3间的肿瘤异质性与细胞的干性-分化轴相一致
由于先前的研究没有很好的揭示PDS3的特点，因此作者进一步分析了PDS3肿瘤内的生物分子间的相互作用。使用 Enrichr和STRING评估 PDS3 特异性基因集（n = 961），发现多梳抑制复合物（polycomb repressive complex ，PRC）的靶向基因在PDS3当中显著富集（图5a）。此外，MYC靶向基因在PDS1,PDS2当中显著富集，在PDS3当中表现缺失（图5b）。MYC和PRC靶向基因表达在患者CRC肿瘤当中表现为负相关（图5c），PDS1表现出高MYC和低PRC得分的干细胞特性，而PDS3表现出低MYC和高PRC得分的分化细胞特性，PDS2则位于两者中间。之后，作者分析了来自6种分化状态的小鼠结直肠上皮细胞转录组数据(GSE143915)，发现Myc-PRC靶向基因和细胞分化状态高度一致（图5d-e）。干细胞和前体肿瘤样细胞表现出高MYC和低PRC基因表达（PDS1）,分化样细胞则表现出低MYC和高PRC基因表达（PDS3）（图5f）。这与先前结论相一致。以上结果表明MYC-PRC轴与PDS分类肿瘤的干性-分化特性转变有关。
为更进一步验证上述结论，作者使用和分析了单独培养或与成纤维细胞和/或巨噬细胞共培养的小鼠 CRC 类器官的scRNA-seq 数据 （n = 29,452，上皮细胞）。通过ssGSEA评分定义PDS1样细胞（高MYC得分）和PDS3样细胞（高PRC得分）。结果发现PDS1样细胞具有典型的干细胞样特性，PDS3样细胞具有分化细胞样特性，且细胞轨迹表现为PDS1朝PDS3样细胞发展（图5h,i）。基于PDS1和PDS3肿瘤的以上特点以及MYC-PRC和干性-分化的关系，作者提出PDS相关的干性-分化得分系统（stem maturation Index, SMI）（图5j）。在单细胞测序数据和转录组数据当中，SMI和PRC的靶向基因得分、分化克隆细胞以及PDS3肿瘤显著相关（图5k-l）。与分化相关的标志基因也在PDS3肿瘤当中富集，且与SMI得分成正相关（图5m）。此外，PDS1-PDS3分析和SMI评分也体现了肿瘤细胞干性-分化特性的转变以及细胞分化轨迹的变化（图5n）。
综上所述，虽然CMS分析和干细胞样分析能推断典型的肿瘤细胞和肿瘤干细胞样状态，但是PDS和SMI评分联合的CRC分型更加能够反映CRC当中肿瘤细胞动态干性-分化特性的变化（图5n），更能反映CRC肿瘤之间的内在联系。
6. 临床前模型无法模拟PDS3肿瘤生物特性
随后，作者使用了人鼠同源基因转化对来自 n = 51个基因工程小鼠模型（GEMM）的肿瘤转录数据进行PDS 分类，评估小鼠模型是否与人PDS肿瘤相似（图6a）。结果显示，A 和 AK模型特异性集中于PDS1，而 KP、KPN 和 BPN 模型被划分PDS2 和 PDS3（n = 1 BPN 为PDS1），BP 模型则对应PDS3（图6b）。同样，在小鼠肿瘤PDS分类当中，PDS1和PDS2的生物学标志、转录因子激活及CMS分类与人相一致（图6b,c）。而人组织当中的PDS3表现出来的转录抑制信号激活则与小鼠的mixed相似（图6b,c）。以上结果说明小鼠模型并不能完全模拟人体CRC的PDS3肿瘤状态。对小鼠肿瘤模型PDS分类进行扩增指数和复制应激压力评估，结果发现PDS1肿瘤的扩增和复制较高，PDS3与PDS2相对较低且表现相似（图6d）。通过计算MYC-PRC靶向信号得分图谱，发现小鼠PDS1与人一致，而不同的是PDS3和PDS2差异性较小（图6e）。小鼠AK模型的类器官高度富集PDS1样干细胞，在沃丁顿样景观当中表现出高分化潜能（图6f,g）。小鼠的无培养基补充剂(WNT3A, EGF, Noggin and R-spondin-1; WENR)野生型（无突变，WT）的类器官则表现出正常细胞样稳态和低分化潜能，与PDS3相似（图6f,g）。值得注意的是在添加了WENR培养基的WT则表现出和PDS1类似的分化潜能，这也回答了临床前PDS3模型缺失的原因-在培养类器官时，培养基当中的促增值因子会改变细胞特性使其朝向PDS1方向发展，导致PDS3的特点缺失（图6h-k）。
以上结果说了目前CRC临床前模型的不足，无法有效模拟PDS3这一预后最差的CRC，严重限制了临床对于CRC治疗的研究；同时也对给未来CRC的临床前模型研究提供了方向。
7. 在单细胞测序数据当中评估PDS相关的特异性表型
紧接着，作者分析了来自5个CRC患者队例的63个单细胞测序样本，共获得49155个上皮细胞。队列中的单个患者的肿瘤细胞状态可以按照 MYC–PRC靶向轴进行分类（图7a-c）。同时，用PDS肿瘤的MYC靶向基因集和PRC靶向基因集也能将患者单细胞样本很好的分类（图7d）。细胞周期相关基因分析显示PDS1肿瘤细胞群高表达MYC基因，且多位于G2M期和S期；PDS3肿瘤细胞群高表达PRC基因，且多位于G1期（图7e）。MYC高表达PDS1肿瘤细胞扩增和复制应激压力升高，KRAS信号抑制表达降低，而PRC高表达PDS3样肿瘤细胞则与之相反（图7f,h）；MYC高表达细胞的CBC和RSC相关基因表达水平高，而PRC高表达细胞的CBC和RSC相关基因表达水平低（图7g,i）。以上结果表明, 在CRC患者的肿瘤细胞水平MYC-PRC靶向轴也具有生物学意义。
8. 结直肠肿瘤的细胞分化轨迹状态
接下来，作者对CRC的单细胞测序数据进行拟时轨迹分析，结果发现每个患者的细胞轨迹都是沿着MYC高表达到PRC高表达方向进行迁徙转变（图8a-e）。CMS分类下的患者细胞轨迹与MYC-PRC轴并不一致，这也说明CMS只能在患者水平上体现其特点，而在细胞水平上则不具有CMS分类特点（图8e-h）。为了探索CMS分类的细胞水平特点，取iCMS2-3每组分组得分的前三分之一的单个患者样本进行单细胞分析。结果发现iCMS2-3与SMI和PDS3呈现负相关（图8i）。以上结果显示了CMS在对CRC分类上的不足，无法在肿瘤细胞层面体现不同分类的特点。而PDS分类能够进一步完善CMS，联合CMS和PDS分类能更好的指导CRC患者的治疗。
小结
本文作者基于现有的CRC分类，提出CMS系统在CRC分型中的不足，并提出新的基于信号通路级别的PDS分类的构想。通过联合分析多个队例的多种转录组数据，作者证明了PDS分类的科学性和普适性以及不同PDS分类与临床预后的关系。通过分析PDS1-3的特点，发现MYC-PRC轴及干性-分化指标（SMI）是联系PDS分类的核心点。此外，作者还运用小鼠模型和类器官模型，发现了目前临床前模型无法模拟PDS3的缺点，为未来临床前模型开发提供方向。同时，运用单细胞测序，鉴定了PDS分类下信号的细胞来源，将PDS分类与肿瘤细胞特点相联系。与已有的CMS相比，PRC对CMS中无法有效区分的部分患者进行了完善，鉴定出以往CMS没有发现的PDS3亚群，弥补了CMS分类的缺点。PDS联合CMS以及其他的指标将指导未来CRC分型和治疗。
Immugent点评
首先解释一下本文的的2个亮点：
以往的对肿瘤分型都是集中于利用基因分子表达差异，实现不同分类间的区分。这种分类会导致不同亚型的肿瘤缺乏特征性的行为表型和临床表现，也容易在不同类别间出现特征表型的重叠。基于通路信号的差异分析聚类能很好的将具有不同行为表型的肿瘤相互之间区分开，并对应临床表现。不同以往的肿瘤分型,本文对PDS分类不同类别之间的内在联系进行了阐述，而且鉴定出了以往CMS分类没有发现的PDS3肿瘤，这是本文一个最大亮点。 在阐述不同PDS分类之间的联系时，本研究有具体的落脚点，鉴定到了关键的分子MYC-PRC以及细胞干性-分化特性，同时利用MYC-PRC/干性-分化轴很好地将PDS的不同类别联系了起来。 当然，本文也存在些许不足之处：
PDS3作为高分化的CRC亚型，反而其预后最差。这种‘悖论’背后的本质是什么？文章当中并没有进一步深入研究； PDS分类对于指导免疫治疗等肿瘤疗法的意义是什么？能否与患者体内的治疗反应相联系？ 具有PDS3特点的肿瘤细胞是否在CRC患者当中真实存在，文章中并没有对这一部分进行实验上的证明。
参考文献:
https://www.nature.com/articles/s41588-024-01654-5
