技术来源
题目：Open-ST: High-resolution spatial transcriptomics in 3D
期刊：Cell
发表时间：June 24，2024
开发团队：柏林医学系统生物学研究所--马克斯-德尔布吕克中心Nikolaus Rajewsky和Nikos Karaiskos团队
背景
空间转录组学（ST）保留了捕获转录组的空间位置信息，可以直接观察组织中的细胞排列和相互作用，从而解锁了组织发育、稳态或疾病背后的分子机制。但是商业化技术提供非靶向的转录组，捕获成本较高并且分辨率有限。探针法靶向预设的基因组，不适合用于无偏发现或空间基因分型；而非商业ST技术则受限于低效捕获、低分辨率或实验设置繁琐复杂。因此亟需操作简单、高分辨率、成本效益高，且可扩展到三维的方法。本期推文介绍的新技术--Open ST，操作简单，低成本且能实现高分辨率和高效的全转录组捕获，以及搭配丰富的实验资源和开源软件，从而完成2D和3D空转数据处理和分析的无缝衔接。
主要内容
1. 技术工作流程
1.1 捕获序列的生成和解离
基于Illumina平台，利用NovaSeq 6000 S4流动池进行mRNA的捕获并测序。流动池含约0.6mm规则间隔的纳米孔，具有空间条形码序列及其匹配的x和y坐标。因此桥接扩增后每个排列的spot都有大量克隆寡核苷酸，具有唯一的条形码序列。利用自定义的3D打印工具将流动池切割成更小的区域进行捕获。
1.2 H&E染色和成像
Open-ST允许从同一冷冻切片中同时分析组织形态（H&E）和ST。染色成像后观察组织细胞形态。
1.3 整合组织形态（H&E）和ST测序数据并分析
进行H&E 图像预处理和细胞分割、数据模态的成对比对、Open-ST 伪图像的生成、三维重建、三维渲染、聚类分析和细胞分型、基因集和通讯分析、分辨率分析、亚细胞定位分析、邻域分析和肿瘤边界分析等。
2. Open-ST 能够高效捕获转录本
研究者成功地将该技术应用于多种组织：胚胎小鼠头部、成年小鼠海马体、人类原发性肿瘤（头颈部鳞状细胞癌）以及患者匹配的健康和转移性淋巴结。所有样本都显示出高比例的转录本（65%-78%）唯一地映射到基因组，核糖体RNA占比低（2.5%-15.3%）。平均55%映射到基因区域的reads被分配到空间条形码，提示约55%的基因区域读取可以关联上空间信息。
小鼠脑部矢状切片E13中，从H&E图像中分割出58,881个细胞。以478百万的深度进行测序后，56,627个细胞（占96%）至少包含一个转录本，其中49,048个（占83%）是高质量的。每个细胞的平均基因数为621和UMI为880。背景转录本所占比例低，分别为核糖体蛋白的15.4%和线粒体编码转录本的3.5%。与其他ST方法进行比较，Open-ST技术对每个细胞的转录本捕获率最高，样本的一致性和精确性上也具有优势，因此作为一种经济高效的高效解决方案脱颖而出。
在人类转移淋巴结的切片中，Open-ST亦展示出稳健性和可重复性，非常适合高通量研究和组织的三维转录组重建。在19个切片上获得了超过1百万细胞的基因表达谱，每个分割细胞的中位捕获基因数（313-624）和UMIs（438-1008）。利用STIM和可视化工具包，研究者校准了使用Open-ST处理的连续切片，重建和可视化一个3D虚拟组织块。空间映射的UMI计数的平滑等值面渲染表明捕获效率可重复，肿瘤区室中可见转录本富集。接下来进行深度测序(1.2B reads)，结果显示低reads/UMI (中位数 = 3.04)，每个分割细胞的中位数为527个基因，878个UMI。reads-to-UMIs比率始终保持较低且在19个切片中具有可比性。
3. Open-ST能够高精确度局部捕获标志基因
研究者用发育中的小鼠图谱作为参考对簇，进行E13切片的标志基因注释。Open-ST数据的聚类反映了小鼠头部的主要解剖区域。利用丰富转录组信息对前脑、中脑和后脑的细胞进行更精细的聚类，结果发现前脑中细胞类型的多样性和细胞的时空分布与通过整合和转移单细胞参考图谱中的细胞类型标签所获得的结果相似。
为了探究捕获定位，将Open-ST测序结果与Allen Atlas原位杂交图像进行对比，两者Neurod6、Pbx3、Tubb3、Ttr和Atoh7的表达高度一致。这展现出了Open-ST高度的精确性。
为了进一步探究Open-ST的亚细胞分辨率，研究者对成年小鼠海马半球的冠状切片进行测序。主要在核内表达的Malat1基因分布在细胞核中，线粒体编码转录本在细胞质中分布，说明该技术可以提供基因表达的亚细胞定位信息。
4. Open-ST解码复杂组织的空间细胞类型
为了展示Open-ST解析结构复杂组织转录组多样性的能力，研究人员对一个原发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）肿瘤和配对的健康和转移淋巴结进行了空间转录组测序。在所有三个数据集中，研究人员识别了肿瘤、基质和免疫细胞对应的转录多样性特征。肿瘤富集的原发样本中的每个细胞的平均基因数和UMI数高于健康淋巴结，分割细胞的注释与空间中标记基因的丰度相匹配。在原发性和转移性肿瘤组织中发现了“角蛋白珠”（KPs），鳞状细胞癌的特征。邻域分析显示这些细胞的位置相近，与它们在肿瘤床中形成紧凑且独特的角质化结构相符。在转移性淋巴结中，CXCL8在CAM群体中表达，与肿瘤和KP共定位。在两个淋巴结中，还鉴定了T细胞（CD3E+）和一个表达IRF8的细胞群，作为干扰素响应的细胞毒性T细胞。多个生发中心被检测到，局部表达FDSCP以及IGHM，这表明它们处于早期生发中心状态。综上所述，Open-ST可以准确解析复杂的人类组织。
5. Open-ST揭示了原发HNSCC和转移淋巴结的空间异质性
通过整合和聚类来自两个样本的42,132个肿瘤细胞，我们识别出10种不同的转录组状态（T1-10），描绘它们的异质性、空间分布和基质相互作用。肿瘤转录组状态在原发和转移样本中显示出不同的空间分布特征。原发性肿瘤中的肿瘤转录组状态为特定状态普遍存在的连续空间域。相比之下，在转移淋巴结中肿瘤状态混杂，没有明确的边界。研究人员进一步通过差异基因表达和基因集富集分析，评估了这些空间组织肿瘤状态的转录组异质性。空间分布的不同肿瘤细胞具有独特的细胞间相互作用和表型。总之，在原发肿瘤中，多种肿瘤状态并存，呈现不同的细胞通讯方式。
6. Open-ST与基于成像的空间转录组学比较
研究人员将Open-ST与基于成像的空间转录组学方法（Xenium In Situ）进行了对比，比较对象为上文提到的原发性HNSCC和转移淋巴结。使用预先设计的人类多组织和癌症探针板 (377个基因)** **模拟了一个对组织分子组成了解很少的场景。结果显示，两种方法在两个样本中都解析了相似的细胞分布特征。另外，与Xenium相比，Open-ST识别出更多的标志基因，但Open-ST比率（相对于总基因数）在Open-ST中较低，因为后者使用了一个经过优化的探针板，利于捕获组织中空间异质性更强的基因。
7. Open-ST用于探索三维虚拟组织块的功能特征
研究人员通过在三维空间中表达选定的标志基因，可视化了淋巴、转移性肿瘤和基质组织隔室。重建的组织可以用于三维分析，查询转录组和成像模式。可以使用体积裁剪和平面剪辑等技术来探索任何方向的基因表达，而无需考虑切片平面。研究人员在可视化ACKR1（特异表达于后毛细血管静脉内皮）后，能够沿着z维度跟踪一条后毛细血管静脉，并揭示其表达是如何局限于转移淋巴结的免疫区域，形成网络状结构。此外，研究人员检查了一个KP，它在初始切片中表现为淋巴结内的孤立结构，发现三维重建其可以于转移瘤连接。最后研究人员还探究了胆固醇合成途径的基因表达在三维空间的分布情况。三维重建的力量远远超出了对细胞类型和组织结构的分析。
总结
Open-ST可以在亚细胞分辨率下实现高效捕获和分析组织空间转录组学特征。作者通过在小鼠及人类组织样本中进行测试，结果都展现较高的细胞分辨率；而且该技术操作简单，性价比高；连续切片的测序数据也展现了该平台的一致性和可重复性；另外，三维重建和多模态分析可以生成三维虚拟组织快，更加精准解析了组织中空间连续结构，识别潜在生物标志物，有助于对肿瘤异质性、肿瘤进化和转移过程及细胞互作等的深入探究。
局限性：不能对FFPE组织进行测序；仅限于多腺苷酸化转录本；不适合低通量实验；分割精度需要提高；整合免疫荧光或免疫组织化学染色可能会对RNA质量以及RNA捕获的位置产生负面影响；z轴与x-y分辨率之间的差异等。
未来改进：将Open-ST与FFPE样本兼容，扩大其适用性；修改和设计捕获寡核苷酸；机构集中生成捕获区域降低成本适用低通量实验；引入膜染色以提高分割精度；优化免疫荧光或免疫组织化学染色条件；发展计算方法对数据进行反卷积处理等。
资源获取：
本文所有实验和计算资源都是开源的~
