前言
新陈代谢是维持正常细胞功能的基本需求之一，每一种细胞都有适合自身的代谢模式，特别是肿瘤细胞的代谢通常与正常细胞显著不同。大量临床研究表明，肿瘤代谢与患者结局密切相关，肿瘤细胞在营养匮乏的情况下通常会调整其代谢策略，以维持生存和增殖。因此，研究肿瘤微环境（TME）中的代谢重编程对于理解癌症机制及开发有效治疗手段具有重要意义。
在过去二十年中，技术创新极大地推动了对细胞代谢的深入研究。代谢组学、稳定同位素示踪和XF细胞外通量分析仪等技术为我们提供了多角度的代谢信息，但这些方法只能揭示部分代谢过程，且实验条件难以准确模拟人体的复杂生理环境。转录组学技术为组织和单细胞水平上的转录组研究提供了强有力的工具。然而，现有的分析方法如ssGSEA、Seurat AddModuleScore和通量平衡分析（FBA），在覆盖范围、通量分布、代谢网络及动态调控等方面存在局限。此外，尽管已有针对代谢的软件工具，如scMetabolism，scFEA和Compass等尝试通过RNA表达数据表征代谢特征，但其在肿瘤单细胞数据中的应用效果和可靠性仍有待进一步验证。
本期推文小编将介绍一款针对肿瘤细胞代谢分析的文章，该研究介绍了一种计算工具-METAFlux，可以从bulk RNA-seq和scRNA-seq数据中预测癌症代谢通量，表征整个代谢回路。尤其对于scRNA-seq数据，METAFlux还能显示TME中细胞类型之间的代谢异质性和相互作用。因此，METAFlux可为深入理解疾病代谢、发现精准治疗靶点提供重要的分析依据。
主要内容
1. METAFlux的开发与方法论
METAFlux的核心是一个基因组规模的代谢模型（GEM）-Human1，该模型集成了 Recon、iHSA 和 HMR 模型，包含13082个生化反应和8378个代谢物，在化学计量一致性、质量百分比和电荷平衡反应方面显著优于其他 GEM。通过基因-蛋白质-反应（GPR）规则，METAFlux能够推导出样本的代谢反应活性评分（MRAS），并结合基因表达数据预测反应活性。
METAFlux使用基于二次规划（QP）的优化方法来进行通量平衡分析（FBA），解决了传统FBA中由于解的退化性导致的多解问题，并通过最小化通量的平方和，获得唯一且非退化的代谢通量分布。
METAFlux还考虑了营养环境的影响，定义了肿瘤细胞可以摄取的营养物质种类。在不同实验中，作者根据培养基成分（如细胞系实验中的F-12培养基）或人体生理环境（如人血液中的营养物质）设定营养物质的摄取和分泌边界，确保模型在生物学上更加符合实际。
对于scRNA-seq数据，METAFlux通过“社区模型”对不同的细胞类型进行代谢交互的建模。该模型在整个肿瘤微环境（TME）内模拟细胞群体间的代谢相互作用，并推断每种细胞类型的平均代谢通量。通过引入自举法，METAFlux能够有效处理单细胞数据的噪声和稀疏性。
2. METAFlux的基准测试
作者选择了NCI-60细胞系数据集中的11个细胞系的数据进行基准测试，METAFlux基于这些细胞系的RNA-seq数据进行代谢通量推断，并与实验测量的真实代谢通量数据进行比较。作者还将METAFlux的结果与现有的代谢通量推断方法（如ecGEMs）进行对比，通过比较Spearman相关系数，METAFlux在11个细胞系中的表现优于ecGEMs，另外METAFlux在26种代谢物中16种的通量预测也优于ecGEMs。
为了进一步验证METAFlux的预测能力，作者使用了一个包含84个三阴性乳腺癌样本的独立数据集，METAFlux预测的葡萄糖摄取通量与PET数据中的标准摄取值SUV数据之间具有统计显著的Spearman相关性，显示了METAFlux在更具生理意义的环境中的有效性。作者还通过分析一组胰腺癌数据集，评估了 METAFlux 预测低灌注、营养贫乏肿瘤中葡萄糖摄取的能力。
3. METAFlux的性能测试
为了验证METAFlux在临床样本中的表现，作者将其应用于TCGA的肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）的RNA-seq数据集。METAFlux的预测结果显示，LUSC样本的葡萄糖摄取水平显著高于LUAD样本，这与独立的18F-FDG PET-CT扫描结果一致。此外，METAFlux还揭示了LUAD亚型中代谢活性较高的亚群，并发现这些亚群与患者的生存预后密切相关。这证明METAFlux不仅能够准确推断代谢通量，还能够识别不同癌症亚型的代谢特征，为临床提供潜在的生物标志物。
作者还使用了来自7名患者的肺腺癌（LUAD）scRNA-seq数据集，以测试METAFlux在单细胞水平上的表现。结果显示，METAFlux能够准确捕捉不同细胞类型之间的代谢异质性。例如，作者发现髓系细胞在葡萄糖摄取方面最为活跃，而上皮细胞的葡萄糖摄取水平相对较低。此外，METAFlux还揭示了肿瘤微环境中细胞之间的代谢竞争和协作关系，例如，B 细胞和 T 细胞释放的丝氨酸可以支持肿瘤细胞的生长，而髓系细胞对丝氨酸的摄取可能与肿瘤细胞竞争。这些结果共同表明，METAFlux在单细胞数据中能够准确预测代谢通量，并揭示复杂的细胞代谢相互作用。
为测试METAFlux在肿瘤免疫治疗中的应用，作者最后使用了来自CAR-NK细胞与Raji淋巴瘤共培养实验的单细胞RNA-seq数据，包括不同类型的CAR-NK细胞产品（如CAR19/IL15 NK细胞、CAR19 NK细胞等）以及它们在不同时间点的代谢数据。作者发现，CAR19/IL15 NK细胞在氧气消耗和葡萄糖摄取方面表现出更强的代谢活性，而随着时间的推移，肿瘤细胞逐渐在代谢竞争中占据优势。通过与Seahorse实验数据对比，METAFlux的预测与实验结果高度一致，成功预测了CAR-NK细胞与肿瘤细胞在营养摄取方面的竞争关系，进一步验证了METAFlux在代谢分析中的准确性。
小结
综上所述，METAFlux计算框架结合了基因表达数据、全基因组规模的代谢模型；同时也基于二次规划的通量平衡分析方法，提供了一个能够从RNA-seq数据推断细胞代谢通量的强有力工具。METAFlux通过考虑营养环境和代谢网络的复杂性，METAFlux不仅可以分析bulk RNA-seq数据，还可以扩展到单细胞层面，捕捉肿瘤微环境中的代谢异质性。
Dablor点评：METAFlux通过将全基因组规模的代谢模型（GEM）与转录组数据相结合，成功推断出肿瘤细胞的代谢通量，这种整合方法为分析代谢重编程提供了新的视角。另外，METAFlux使用二次规划方法（QP）解决了传统FBA中解的退化性问题，这是提升计算精度的一大进步。然而，代谢网络的模型依赖于多个假设，如稳态假设等，这些假设虽然在计算中有助于简化问题，但在某些生物学场景中可能不完全适用。因此，在使用这些模型进行推断时，应仔细考量假设的合理性，并结合实验数据进行验证。但令人憧憬的是，METAFlux不仅适用于癌症代谢研究，还可能扩展到其他生物学领域，如代谢性疾病（糖尿病、肥胖症等）或发育生物学中的代谢分析。
[参考文献] https://www.nature.com/articles/s41467-023-40457-w
