前言
T 细胞耗竭是指T细胞在受到慢性抗原刺激后不断失能的过程，虽然生理状态下它可以防止过度的免疫介导的组织损伤，但也会纵容病毒或肿瘤的持续存在。这一过程涵盖了从具有干细胞特征的增殖性T细胞（耗竭前T细胞）到完全丧失效应功能和增殖能力的T细胞（终末耗竭T细胞）。因此，T细胞耗竭被认为是对免疫检查点抑制剂和过继性细胞转移疗法耐药的主要途径之一。2022年Nature Reviews Clinical Oncology发表的一篇综述，系统介绍了T细胞耗竭相关免疫治疗的最新发现，非常值得一读。
本文重点
T细胞耗竭是一种功能低下的状态，这种状态与免疫检查点抑制剂（ICIs）和过继性T细胞疗法的疗效降低有关； T细胞耗竭的分子特征与肿瘤反应性T细胞受体（TCR）的克隆型相关，可以用来预测ICIs的疗效； ICIs疗法的有效性依赖于耗竭前CD8+ T细胞的外周扩展和肿瘤浸润； T细胞耗竭程序会保护CD8+ T细胞免受过度刺激引起的细胞死亡，因此，中断这一程序可能会损害肿瘤反应性T细胞在肿瘤患者体内的持久性； 优化嵌合抗原受体和下游信号传导、干预转录和表观遗传状态以及改善代谢功能障碍可以减轻T细胞的耗竭（而不是中断这一程序），从而增强嵌合抗原受体（CAR）工程和TCR工程细胞疗法的疗效。
主要内容
T细胞耗竭是一种与持续抗原暴露相关的、T细胞效应功能逐步下降的细胞分化途径，T细胞受体（TCR）和下游Ca2+信号的持续刺激会激活转录因子NFAT，进而驱动TOX和NR4A家族转录因子的表达。因此，T细胞中的NFAT信号传导导致多种抑制性免疫检查点蛋白的转录上调，包括PD-1、CTLA4、CD39和LAG3。T细胞耗竭的过程是从具有干细胞样特性的高增殖性T细胞（称为“耗竭前T细胞”）到完全失去效应功能和复制能力的T细胞（通常称为“终末耗竭T细胞”）的过程。本文对于T细胞耗竭的定义是在遇到肿瘤细胞时效应功能降低，并且伴有共抑制标志物表达和炎症细胞因子（如IFNγ和TNF）产生减少的状态。这一点需要区别于T细胞的无知、耐受、失能，见下面这部分。
多种机制可导致T细胞功能低下，包括无知、失能、耐受和耗竭：
1. 无知：由于抗原表达水平低（肿瘤发生初期），导致T细胞缺乏响应。
2. 耐受：中枢或外周自身反应性T细胞的失活。
3. 失能：T细胞在缺乏抗原呈递细胞（APCs）和/或CD4+ T细胞的共刺激信号的前提下，抗原诱导了T细胞受体（TCR）和下游NFAT信号传导后的一种功能低下状态。失能的T细胞也可表达抑制性免疫检查点受体PD-1和CTLA4，很难与耗竭的T细胞区分。
4. 耗竭：由于持续的抗原暴露和慢性TCR信号刺激，T细胞功能逐渐下降的状态。这一过程与失能的区别在于，这些T细胞已经通过APCs在次级淋巴器官中发生了初次激活（例如，共刺激）。耗竭的T细胞特征是细胞因子生产减少和抑制性受体（如PD-1、CTLA4和LAG3）以及免疫抑制酶CD39的表达增加。这些受体也由生理上功能正常的T细胞在APC介导的初次激活后表达；然而，当在肿瘤内表达时（特别是在肿瘤形成需要数月到数年的肿瘤患者中），这些标记物表示T细胞耗竭。
注意：这些概念都是在特定条件下定义的。在临床并没有明确的表型可以区分这些状态。因此，一些研究使用了“功能障碍（dysfunctional）”这一术语。也有其他功能低下的T细胞状态的描述，这些状态与上述四种典型概念有重叠，包括终末分化、激活诱导的细胞死亡、细胞衰老、耗竭和代谢障碍。这些T细胞状态之间的重叠程度也是一个持续被研究的领域。
关于免疫检查点抑制剂的多项研究表明，T细胞耗竭是通过表观遗传调节的，并且PD-1抑制只能部分逆转与耗竭相关的转录表型。通过使用ICIs移除T细胞上的“刹车”可以使克隆扩增的CD8+ T细胞恢复活力。从这里延伸出的假设包括：（1）在肿瘤–T细胞互作中消除额外的免疫检查点（如LAG3、TIM3和/或TIGIT）可能会增强CTLA4和PD-(L)1抑制剂的疗效，（2）中断耗竭程序可以在T细胞介导的免疫治疗中起到治疗作用。
与免疫检查点抑制剂疗法同时兴起的，是基因工程嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继治疗。CAR T细胞是通过表达外源构建的CAR（由胞外肿瘤靶向基序与来自TCR CD3ζ链和共刺激受体的胞内信号域耦合而成）实现抗原特异性的自体T细胞疗法。目前大多数接受CAR T细胞疗法的患者最终都会出现复发。
通过总结过去十年中关于T细胞耗竭的研究，本文总结T细胞耗竭不仅仅是肿瘤控制不良的原因，它是抗肿瘤治疗效果不佳的一个反馈。在某些情况下，中断耗竭程序可能对T细胞介导的抗肿瘤免疫产生不利影响，专注于减轻（或避免）而不是中断T细胞耗竭的策略可能会更有效果。
一、T细胞耗竭的辩证
耗竭的CD8+ T细胞富含肿瘤反应性克隆
多项研究表明，CD8+ TILs具有与T细胞功能障碍相关的基因signature，如高表达PDCD1（编码PD-1）、ENTPD1（CD39）、LAG3、HAVCR2（TIM3）、ITGAE（CD103）、CXCL13、TNFRSF9（4-1BB）以及一些与细胞增殖相关的基因，表明这些T细胞具有增强的而非减少的增殖能力。在2020年发表的一篇综述中总结了这些发现，并确定PD-1、CD39、TIM3、LAG3、CXCL13、4-1BB、GITR、增殖标志物和寡克隆TCR谱系是肿瘤反应性CD8+ T细胞的标志。很明显，这些肿瘤反应性标志物中的许多也被认为是CD8+ T细胞耗竭的标志。
相比之下，旁观者T细胞的肿瘤特异性signature的表达水平较低。但是同样值得注意的是，高表达耗竭标志物如PD-1、CD39和/或CTLA4的CD8+ TILs在治疗前或治疗初期的高丰度能够预测ICIs的临床效果。
肿瘤持续存在时，T细胞耗竭不可避免
在慢性抗原暴露的情况下，CD8+ TILs的耗竭是不可避免的。这可能能说明为什么CD8+ T细胞耗竭可以在治疗前和治疗初期预测ICIs的临床效果，同时也暗示可以通过治疗去增强的预先存在的抗肿瘤T细胞的效应，而在治疗后期和治疗后观察到的同样信号却预示着不良结果，这表明尽管进行了治疗干预，但仍存在耗竭作为肿瘤持续存在的指标。
ICIs与正交（即非ICI）干预（对肿瘤细胞具有细胞毒作用）同时使用，可能会带来额外好处。因此，通过减少驱动T细胞耗竭的抗原负荷，正交疗法（如化疗、受体酪氨酸激酶靶向治疗、放疗和/或手术切除）可能会改善ICIs的效果。
之前普遍认为T细胞耗竭是肿瘤控制不良的一个重要原因，但或许同样正确的是，T细胞耗竭也是肿瘤控制不良的一个结果。
二、对ICIs机制的全新见解
肿瘤引流淋巴结中的PD-L1+ cDCs是ICIs的关键靶点
如果在肿瘤微环境（TME）中逆转肿瘤反应性CD8+ T细胞的耗竭是免疫检查点抑制剂（ICIs）的主要治疗机制的话，那么理论上，在阻断微环境之外的T细胞浸润到肿瘤的情况下，疗效是不会受到影响的。然而，在多种小鼠模型中，在抗PD-(L)1治疗前使用鞘氨醇1-磷酸受体激动剂FTY720阻断T细胞从次级淋巴器官的流出，治疗效果被明显减弱。阻断淋巴器官外流会极大程度消除新的CD8+ T细胞向肿瘤的募集，所以仅在TME中恢复T细胞活力不足以解释抗PD-(L)1的疗效。这就引发了一个问题，即TME以外的哪个部位是PD-1–PD-L1轴阻断的关键目标。
对腹膜肿瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中的免疫细胞进行分析，显示出肿瘤反应性PD-1+ T细胞的富集以及髓系细胞群体上PD-L1的高表达。皮内注射抗PD-L1抗体与典型的腹腔内（系统性）给药相比，会优先靶向TDLN并表现出更优的抗肿瘤活性。这意味着淋巴组织中一定存在着可以被ICIs干扰的PD-L1+细胞群体。
在上述模型中，TDLN中的PD-1+ T细胞与PD-L1+经典树突状细胞（cDCs）紧密相邻，阻断这些cDCs上的PD-L1会诱导耗竭前T细胞的产生并迁移到肿瘤中。这些结果表明，TDLN中的cDCs是PD-1–PD-L1轴阻断的关键目标。
ICIs的效果依赖于TCF1+ 耗竭前CD8+ T细胞
如果抗PD-(L)1的疗效依赖于肿瘤引流淋巴结（TDLN）中的细胞相互作用而非肿瘤微环境（TME），那么位于淋巴组织中的肿瘤反应性PD-1+CD8+ T细胞群一定是恢复活力的关键干预对象。
多项研究证明，位于淋巴组织中的CXCR5+TCF1+PD-1+CD8+ T细胞群体在慢性病毒感染情况下，是终末耗竭CD8+ T细胞的前体来源。这些细胞有时被称为“耗竭前”、“记忆样”、“干细胞样”和“滤泡细胞毒性”，但“耗竭前”可能是描述此状态的相对准确的专业术语。
PD-1–PD-L1轴的阻断主要在次级淋巴器官中起作用，在抗PD-(L)1抗体治疗后就会发现T细胞增殖爆发的证据，并且扩增的耗竭前T细胞会通过循环迁移至肿瘤。
新机制对于ICI治疗效果的启示
过去认为PD-(L)1抑制剂的靶点仅存在于TME内。但实际上，从患者肿瘤样本中得到的T细胞具有双重来源（即预存TILs的扩增和新浸润T细胞的克隆替换），被称为“克隆复活（clonal revival）”，针对这一概念可以延伸推测不同肿瘤中这两种肿瘤反应性T细胞的贡献差异。
但总的来说，在ICI疗法中最重要的部分是由新浸润的CD8+ T细胞完成的。抗PD-(L)1抗体的关键靶点是肿瘤引流淋巴结（TDLNs）中耗竭前PD-1+CD8+ T细胞和PD-L1+常规树突状细胞（cDCs）之间的相互作用，这会导致耗竭前T细胞的增殖爆发，经循环到达肿瘤微环境并在肿瘤微环境（TME）中分化为终末耗竭T细胞。这一认识扩展了我们对为何肿瘤内PD-L1表达作为预测ICI疗效的指标并不充分的理解，同时也解释了为何PD-L1缺乏的小鼠和患者仍然能从这种治疗中获益的矛盾。
也许从表面上看，说外周来源的CD8+ T细胞非常重要可能并不符合上面的假设，毕竟肿瘤内耗竭T细胞的丰度才是预测ICI效果的指标。换句话说，如果PD-1/PD-L1抑制的真正靶点是远离肿瘤的，那么为何浸润到肿瘤微环境中的T细胞上PD-1和CD39的表达能起到预测治疗效果的作用？一种可能是，肿瘤内肿瘤反应性PD-1+ CD39+ CD8+ T细胞的丰度与外周肿瘤反应性T细胞克隆的数量成比例，而这些克隆可以在PD-1/PD-L1轴阻断后被激活。
总体而言，上述“全新见解”对ICI疗法有两个重要影响：
首先，如果你使用ICIs的理由是TME中PD-L1的上调时，应当谨慎。只有PD-L1表达作为微环境中预先存在的抗肿瘤CD8+ T细胞效应的指标时这个理由才有效，而不是其他肿瘤内因素上调的PD-L1表达。
其次，基于ICIs的组合疗法应侧重于增加肿瘤反应性T细胞数量，而不是试图“解除”TME中终末分化细胞的耗竭状态。因此，应该关注那些能够增加现有肿瘤反应性T细胞克隆型和/或募集其他肿瘤反应性TCR CD8+ T细胞的疗法。
三、CAR T细胞耗竭
CAR T细胞疗法后的肿瘤复发仍然是一个巨大挑战。在CAR T细胞制造过程中T细胞即可出现耗竭的表观遗传标志。
阻断CAR T细胞耗竭
如果CAR T细胞确实能受到耗竭的影响，那中断这种功能低下状态就能改善治疗效果，最简单的方法是与抗PD-(L)1联合。在一项研究中，使用抗CD19 CAR T细胞（axicabtagene ciloleucel）联合早期PD-L1阻断（细胞输注后1-21天开始使用atezolizumab）治疗DLBCL的持久反应率与单独使用CAR T细胞的持久反应率相似，表明ICIs联合治疗没有带来额外效果。说明阻断PD-1–PD-L1轴不足以在表观遗传层面上重编程T细胞耗竭。
在抑制PD-1或其他共抑制受体信号的几种方法中（除了与ICIs联合治疗），一种方法是工程化CAR T细胞以分泌拮抗性抗体(fig. 2)。另一种方法是过表达PD-1显性负受体（DNR）或对CAR T细胞中的PDCD1基因座进行基因编辑，以本质上消除PD-1信号传导。每种方法都有其优点和缺点，尚无最佳策略。
改善CAR T细胞的功能的措施如图，分为减轻T细胞耗竭(A部分)或更直接地中断NFAT信号传导下游的耗竭级联(b部分)的策略。
减轻T细胞耗竭
针对T细胞分化早期的干预可能是提高抗肿瘤免疫最有效的。改善细胞培养条件和优化CAR设计和下游信号传导等方式能减轻而不是中断T细胞耗竭(fig. 2)。
增加CAR T细胞与肿瘤细胞的比率
T细胞耗竭可以通过肿瘤微环境（TME）中的代谢和基质因素进行调节。由于更高的肿瘤抗原负荷导致持续的CAR刺激，从而导致CAR T细胞耗竭，表明在CAR T细胞治疗前进行细胞减负以限制耗竭的可行性。另一方面，可以考虑增加输注的CAR T细胞数量，包括使用CAR靶向抗原进行疫苗接种。
优化T细胞培养条件
制造可用于临床的CAR T细胞需要一系列优化程序。在CAR T细胞制造过程中对培养持续时间、细胞因子补充和PI3K/AKT抑制的干预是临床测试的潜在途径。
优化CAR结构
在内源性T细胞中，耗竭是由TCR信号反复刺激引起的。CAR的设计可以影响CAR T细胞的功能、持久性和耗竭。CAR设计对T细胞耗竭的影响首先在共刺激结构域中得到了证明。与CD28的共刺激相比，基于4-1BB的CAR设计诱导的T细胞耗竭更少（而基于CD28的CAR T细胞则增强了糖酵解）。
CAR信号强度还可以通过编辑TCR衍生的CD3ζ信号域直接进行调节。通过消除CD28基础CAR结构中的三个免疫受体酪氨酸活化基序中的两个（称为1XX）来调节CD3ζ信号传导，可以减少T细胞耗竭。
自发的、抗原非依赖性的信号传导是导致过度T细胞耗竭的另一种慢性刺激来源，某些CAR结构天生倾向于驱动持续的、低水平的下游信号传导。这种自发信号传导被认为是通过CAR在细胞膜上的聚集导致的，表现为CD3ζ磷酸化和即使在没有目标抗原的情况下也会过度表达与T细胞耗竭相关的转录因子。
通过药物启动“关闭”信号也是一种策略。例如，酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼被认为是CAR T细胞的药理“开关”，因为它能够抑制CD3ζ磷酸化，使用达沙替尼产生的暂时性CAR信号抑制能够恢复耗竭的CAR T细胞的抗肿瘤功能。
调节转录程序
T细胞功能与耗竭之间的平衡发生在TCR信号传导的下游，是基于转录因子AP-1及其结合分子NFAT之间的一个平衡。上游TCR或CAR信号传导，包括自发性CAR信号传导，驱动钙诱导的钙调磷酸酶激活，随后导致NFAT去磷酸化和核转位。T细胞中AP-1和NFAT的结合会导致强烈的IL-2表达和效应功能；然而，如果T细胞信号发生持续的信号传导，使FOS和JUN的表达下降，会导致NFAT信号传导失调。因此，强制表达JUN可以克服由自发性信号传导引起的T细胞耗竭。同理，转录因子BATF的过表达也能对抗NFAT诱导的耗竭，通过与IRF4结合减轻转录耗竭程序并增强CAR T细胞功能(fig. 2)。
减轻代谢障碍
持续的T细胞刺激也与线粒体功能障碍有关。代谢和肿瘤微环境（如缺氧）会调节T细胞耗竭，并触发由转录抑制因子BLIMP1（也称为PRDM1）驱动的失调的代谢程序，导致转录共激活因子PGC1α的沉默。
线粒体功能障碍导致活性氧（ROS）的生成增加，限制了CAR T细胞的生存和自我更新，而使用N-乙酰半胱氨酸或烟酰胺清除ROS可以恢复T细胞的抗肿瘤效应。所以耗竭程序可能是一种限制TCR过度刺激和相关的代谢功能障碍的机制，如果不对TCR过度刺激和代谢障碍加以缓解，可能会导致T细胞死亡。
四、结论
对肿瘤患者的治疗，非耗竭的肿瘤反应性T细胞无疑是优于耗竭细胞的。然而，本文总结的观点是：在持续抗原暴露的情况下，耗竭是不可避免的。因此，试图逆转耗竭状态可能是错误的！而且，还有某些更复杂的情况，强行阻断耗竭程序可能会损害T细胞的持久性。提高免疫治疗疗效的最大希望是减轻诱导T细胞耗竭的因素，而非完全终端耗竭程序。
点评
本文的核心观点：在肿瘤环境中耗竭是不可避免的；中断T细胞耗竭是有潜在风险的；减轻/延缓T细胞耗竭可能是治疗肿瘤的最佳策略。这篇文章通过总结近10年T细胞耗竭研究相关的重点文献，对简单地中断T细胞耗竭提出质疑，揭示了T细胞耗竭过程的复杂性。基于本文的假设，提出了在时间上（早期干预）和方法上（信号转导、转录、表观遗传、代谢）减轻T细胞耗竭的重要性，对于关注T细胞耗竭的研究者来说是一篇很好的参考。
文献来源
Chow, A., Perica, K., Klebanoff, C. A. & Wolchok, J. D. Clinical implications of T cell exhaustion for cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol (2022) doi:10.1038/s41571-022-00689-z.
