近日，Scientia Horticulturae在线发表了西南林业大学林学院张汉尧课题组题为Genome-wide
identification of carotenoid cleavage oxygenase genes in Orah mandarin and the
mechanism by which CrCCD4b1 affects peel color的研究论文。https://doi.org/10.1016/j.scienta.2024.113652颜色是柑橘类水果商品价值的重要组成部分，由类胡萝卜素的成分和含量所决定。类胡萝卜素裂解加氧酶（CCOs）可以通过氧化裂解不同的类胡萝卜素位点，由此生成各种颜色的四萜烯化合物，从而影响果实的颜色。针对本地区沃柑果实转色困难的问题，本研究采用生物信息学方法对沃柑CCOs基因家族进行了全基因组分析，并结合生理学、转录组学和代谢组学数据，分析不同颜色果皮的基因表达水平和类胡萝卜素积累机制，为进一步研究造成果皮色泽差异的成因及挖掘调控红色性状的关键基因打下基础。红色沃柑具有更高的a∗和CI，而L∗、b∗和H°均为下降趋势，除b∗之外，其余值均存在显著差异，表明不同颜色的沃柑主要由a∗和CI来决定，该值越大，则果皮的颜色越偏向红色。相关性分析分析表明沃柑颜色参数（a∗,CI）与总类胡萝卜素含量呈强正相关。这些发现表明总类胡萝卜素的含量与沃柑果实的颜色有密切的关系。图1 不同颜色沃柑的颜色空间和总类胡萝卜素含量的变化2.CrCCOs基因家族的鉴定、分类和系统发育分析 通过本地Blast比对、Hmmer检索和NCBI-CCD结构域的分析验证，最终在沃柑中鉴定了14个CCO基因。序列相似性和系统发生树结果表明，CrCCOs基因家族分为6个亚族：CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、NCED和CCD-like。3. CrCCOs基因的基因结构、保守结构域和保守基序基因结构分析表明，CrCCOs家族成员的基因结构是多样的，同一分支的基因外显子和内含子结构更为相似，且不同分支的外显子和内含子数量存在显著差异。每个亚族成员所含有的基序数量，不同组间的基序组成和数量均有显著差异。92.9%的CCOs均含有Motif1和Motif2，表明其可能在一些常见的生物学功能中发挥重要作用。此外，基序组成和数量在不同亚族间并不总是高度保守。图3 CrCCOs的系统发生树、保守基序、保守结构域和基因结构4. CrCCOs基因启动子序列的顺势作用元件分析 顺势作用元件分析发现，除了TATA-box、CAAT-box和一些功能未知的元件外，共鉴定出345个顺势作用元件，这些元件可分为非生物和生物胁迫响应元件（18%）、植物激素响应元件（32.8%）和植物生长和发育响应元件（49.2%）这三个类型。在大多数的CrCCOs的启动子中都发现了脱落酸响应元件ABRE，还含有大量光响应元件Box4和G-box，占比达到了该类元件的53.6%，光照能影响该基因对类胡萝卜素含量的作用。这些结果表明，CrCCOs家族基因可能与多种转录调控机制有关。CrCCOs基因家族中共有7个基因在果皮中表达，在不同颜色的果皮中，4个表达上调，3个表达下调，其中CrCCD4b1、CrCCD8b和CrNCED5基因表现为上调DEG，CrCCD4a为下调DEG。GO和KEGG富集分析结果显示，GO
terms主要分布在类胡萝卜素的合成与分解过程、一些酶的催化活性以及和类胡萝卜素相关物质的代谢过程和场所等，其中与类胡萝卜素代谢直接相关的GO
terms有5个，占到了GO
terms总数的三分之一；此外，12个（85.7%）基因均富集到了Carotenoid
biosynthesis通路上。通过UHPLC-MS靶向代谢组技术对样品中的类胡萝卜素代谢物进行分析，共鉴定出15种类胡萝卜素代谢物。可分为胡萝卜素carotenes（3.92%）和叶黄素xanthophylls（96.08%）两大类，发现总xanthophylls含量在红色果皮中的显著高于黄色果皮，且总carotenes含量几乎没有变化。在PCA的得分图中，两个主成分的累计贡献率累积达到了87.63%，OPLS-DA模型验证结果显示R2Y和Q2值均大于0.9。我们在各组样本间共统计到5个DAM，Apocarotenal和β-citraurin的倍数变化最大，分别达到8.6和18.1倍，这些代谢物可能是决定沃柑果皮颜色形成的重要代谢物。
Pearson相关性系数显示，共有12个CCOs成员与13个类胡萝卜素的代谢物具有相关性。其中2个CrCCOs成员（CrCCD4b1、CrNCED5）的表达水平与样本中检测到的Apocarotenal和β-citraurin之间存在显著的相关性。此外，CrCCD4a、CrNCED3和上述的两个DAM的含量为负相关的关系，能够起到负向调控的作用。
图7 沃柑CCOs基因与类胡萝卜素代谢物的相关性分析通过miRNA靶向位点的预测，我们共发现了39个miRNAs通过inhibition 机制靶向调控13个（92.9%）CrCCOs。我们还筛选了与CrCCD4b1相关的靶向miRNA，发现同一个miRNA可以与多个CrCCOs基因相互作用。CrCCD4b1、CrNCED3和CrNCED5可以靶向多个miRNAs位点，形成miRNA-Gene-mRNA调控的网络，参与CrCCOs转录后的表达调控。基于本研究的结果，我们提出了一个具体的调控模型以解释CCOs基因介导类胡萝卜素生物合成途径，从而改变Orah mandarin果皮的颜色性状。图8 CrCCD4b1正向调控类胡萝卜素生物合成途径促进沃柑果皮红色性状的模型本研究从沃柑全基因组中鉴定并表征了14个CCO基因的功能，研究了其在不同颜色果皮中的表达谱，发现CrCCD4b1的表达水平能影响果皮颜色。同时发现红色果皮的color
index和总类胡萝卜素含量比黄色的更高，Apocarotenal、β-citraurin是果皮中控制红色果皮性状的主要代谢物。此外，还提出了CrCCD4b1调控沃柑果皮中C30类胡萝卜素（Apocarotenal、β-citraurin）生物合成的模型。本研究揭示了CrCCOs基因家族对类胡萝卜素生物合成的调控机制，为改善沃柑果皮色泽提供理论依据。西南林业大学林学院张汉尧教授和刘小珍副教授为该论文通讯作者，硕士研究生文科为该论文第一作者，硕士研究生黎旭琳为共同第一作者。云南省农业科学院周先艳副研究员对该研究进行了指导。该项目得到云南省乡村振兴科技专项（202304BP090005）、云南省院士(专家)工作站项目（202305AF150020）、云南省新平柑橘科技小院、西南林业大学林学一流学科建设项目和西南林业大学博士科研启动基金的资助。通讯作者简介：张汉尧，男，归国博士后，教授，博士生导师。西南林业大学学术委员会委员，昆明市学术与技术带头人后备人才，云南省省级工业和信息化咨询专家，云南省、江西省和河北省自然科学基金及国家自然科学基金通讯评审专家，云南省园艺学会常务理事，林木抗逆材料选育与利用国家创新联盟理事。先后主持云南省外专局引进项目、云南省教育厅重点项目、云南省自然科学基金项目、国家自然基金项目、国家重大研发专项子课题、国家林业局“948”项目、教育国归人员启动基金项目、国家星火计划项目等十余项研究工作。发表SCI论文55篇，他引次数合计420以上，已授权发明专利13项。分别获“海南省科技进步三等奖”、“海南省科学进步二等奖”和“梁希林业科技进步三等奖”各一项。
团队研究方向：植物分子育种和酵母分子遗传。
About Scientia HorticulturaeScientia Horticulturae属农林科学Top期刊，由Elsevier出版社出版，发表果树、蔬菜、观赏植物和食用菌生产等与园艺有关（栽培、育种、生物化学、组织培养、营养学、植物生理学、植物病理学等)的原创论文，综述和短讯等。CiteScore：8.6 ,期刊影响因子：3.9。2023年中科院期刊分区，中科院大类：农林科学2区，Top期刊；中科院小类：园艺2区。JCR分区：Q1 （6/115 Horticulture）。
