研究背景
柑橘四倍体对多种生物胁迫和非生物胁迫具有优越抗性，同时拥有果实变大、种子数减少、矮化等优良特征，具有重要育种应用价值。前人通过原生质体融合、珠心胚细胞自然加倍和秋水仙素诱导等途径已创制大批柑橘多胚性四倍体。但多胚性是柑橘有性杂交的障碍，以多胚性四倍体为母本与二倍体杂交培育三倍体，合子胚极易败育，需要费时费力进行幼胚挽救培养。而以柑橘单胚性四倍体为母本与二倍体杂交不存在上述问题，但目前柑橘单胚性四倍体种质创制研究报道较少，且通常需要结合茎尖微芽嫁接、离体组织培养等技术，诱导效率不高。为此，本研究基于柑橘上胚轴愈伤组织再生能力强的特性，开发了一种高效的柑橘单胚性品种四倍体活体诱导技术。该方法无需组织培养，从种子萌发到再生四倍体不定芽仅需45天，本研究成功诱导出5个柑橘单胚性类型和品种的四倍体植株。
研究结果
1）上胚轴诱导体系建立与优化
本研究具体诱导方法如下：秋辉橘单胚种子催芽播种，幼苗长至5-7 cm时，在上胚轴2-3 cm处切断，保留2-3 cm长度上胚轴。将横切的幼苗黑暗培养促进上胚轴伤口形成愈伤组织；用酒精灯封闭一个20μl的白色移液器吸头，并使用注射器加入含1% DMSO的秋水仙素；将装有秋水仙素的吸头倒置并扣于横切后的上胚轴，使切口愈伤组织浸泡于秋水仙素溶液，而后去掉白色吸头将花盆覆盖塑料薄膜以保持湿度，并置于于生长室光照环境继续培养，促进愈伤组织再生不定芽；待不定芽生长到3-5片真叶时，采用流式细胞术对再生植株进行倍性鉴定。
图1 秋辉橘上胚轴诱导四倍体流程
2）上胚轴愈伤组织和不定芽发育状态观察
为了更好设计试验，对上胚轴切口的愈伤组织和不定芽发育状态进行观察。幼苗上胚轴横切后，在湿润和黑暗条件下伤口会迅速形成愈伤组织，在0-6天期间切口处愈伤组织持续膨大，在第9天开始愈伤组织出现芽点，之后不断膨大。自15天起，不定芽于光照下培养，17-25天期间不定芽变绿并迅速生长。因此，本研究设计了不同黑暗时间条件处理（0、3、6、9、12、15天）诱导切口形成愈伤组织，同时用不同浓度的秋水仙素溶液（0.0125%， 0.025%，0.05%，0.10%）处理切口处愈伤组织2小时，共计24个不同处理试验组。
图2 上胚轴切口愈伤组织形成与不定芽再生过程
（A）黑暗条件下愈伤组织生长状态；（B）：光照条件下不定芽再生
3）最佳诱导条件
根据倍性鉴定结果得到结论：1）随着暗培养时间增加，四倍体诱导率和混倍体发生率均呈逐渐升高趋势，而在较低的秋水仙素浓度0.0125%和0.025%观察到更高的四倍体诱导率；2）秋水仙素对上胚轴具有毒性，较高浓度的秋水仙素处理后不定芽再生效率降低；3）最佳处理方案是黑暗处理9天诱导愈伤组织后，用0.025%的秋水仙素浸泡愈伤组织，此时具有较高的四倍体诱导率（20.7%）和较低的混倍体发生率（1.7%）。
图3 秋水仙素浓度和暗培养时间对四倍体诱导率和混倍体发生率的影响
4）不同柑橘单胚性品种四倍体诱导与鉴定
为了验证该方法在柑橘类果树的普遍适用性，对黄陵庙橘、琥珀甜橙、HB柚和枸橼4个单胚性柑橘品种进行四倍体诱导。流式细胞术鉴定表明，四倍体诱导率分别为17.4%、14.3%、15.0%、16.4%，混倍体发生率均处于较低水平（3.7%-5.3%），说明该四倍体活体诱导技术体系适用于柑橘各类型（橘、橙、柚、枸橼）单胚性品种的四倍体诱导。InDel分子标记显示，诱导的23株黄陵庙四倍体植株中有21株为单胚基因型，22株琥珀甜橙中有6株为单胚基因型，16株HB柚和17株枸橼四倍体再生植株均为单胚基因型。
图4 柑橘4个单胚基因型诱导再生四倍体植株及单多胚鉴定。
（A）黄陵庙橘、琥珀甜橙、HB柚、枸橼四倍体和二倍体再生植株（B）黄陵庙橘四倍体单/多胚性鉴定（C）HB柚四倍体单/多胚性鉴定（D）琥珀甜橙四倍体单/多胚性鉴定（E）枸橼四倍体单/多胚性鉴定
5）一年苗龄四倍体再生植株倍性再鉴定
为了评估四倍体植株是否维持稳定的倍性水平，在温室生长一年后，从每一植株的不同部位采集叶片进行流式细胞术第二次倍性鉴定，在诱导的68株秋辉橘四倍体再生植株中，有61株保持四倍体倍性，7株恢复为二倍性，1株为混倍体。5个单胚性品种均有较高比例（75%-100%）的四倍体植株维持纯合四倍体倍性水平，说明采用该诱导技术体系能获得倍性稳定的四倍体再生植株。
图5 秋辉橘一年苗龄四倍体再生植株倍性再鉴定。（A）倍性稳定植株（B）恢复倍性植株
6）结论
基于柑橘上胚轴再生能力强的特性，本研究建立了一种高效且不需要组织培养的四倍体活体诱导技术体系，可在45天内获得倍性稳定的四倍体再生植株，四倍体诱导效率高（＞20%），混倍体发生率低（约1.7%）。将该技术体系用于黄陵庙橘、琥珀甜橙、HB柚和枸橼等单胚性柑橘品种四倍体诱导，均获得了倍性稳定的四倍体再生植株，进一步说明该技术体系适用于柑橘各种单胚性品种的四倍体诱导。
研究获得的单胚性四倍体将进一步丰富和拓展柑橘倍性育种亲本资源，对于种质创新具有重要意义。以单胚性四倍体为母本与二倍体杂交，无需离体幼胚挽救过程，种子成苗即为三倍体杂种，将显著提高三倍体育种效率。柑橘四倍体相比二倍体栽培品种具有果实变大、精油含量提高等品质特征和矮化、抗性增强、种子数减少、熟期改变等优良特性，经评价也可能具有直接推广应用的潜力。
华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室郭文武教授课题组完成了此项工作，博士生任杰和已毕业硕士生卢鑫为该论文共同第一作者。本研究受国家重点研发计划（2023YFD1200103）、国家自然科学基金（32172525）、湖北省农业农村厅项目（HBZY2023B00501）和国家现代农业（柑橘）产业技术体系（CARS-26）资助。
