论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.scienta.2024.113615
研究背景
抗坏血酸(AsA)，也被称为维生素C，在植物整个生长发育过程中对一系列代谢过程进行调控，包括细胞分裂、应激反应、衰老调节、糖代谢、光合结构的光保护、诱导开花和离子运输。此外，AsA是植物抵御各种胁迫的必要条件。鉴于不同白菜品种间AsA含量的巨大差异，研究白菜中AsA合成相关关键基因的功能至关重要。研究表明，L-半乳糖途径是高等植物合成AsA的主要途径，而在L -半乳糖途径中，L -半乳糖脱氢酶(L-GalDH/ GDH)促进L -半乳糖(L-Gal)转化为L -半乳糖-1,4-内酯(GLDH)，后者是AsA合成的直接前体。目前，白菜GDH (BrGDH)在AsA合成中的作用尚不清楚，有待进一步研究。
研究结果
1. BrGDH的氨基酸序列及系统发育关系分析
以大白菜‘HK-8’的叶片为样品，通过克隆BrGDH（Gene ID: Bra036989）的核苷酸序列，结果显示其开放阅读框序列长度为972 bp，共编码323个氨基酸（图1A）。用ExPASy程序中ProtParam工具分析BrGDH基因编码的蛋白质的相对分子质量为79750.98 Da，理论等电点为5.08；通过TMHMM Server v.2.0和SMART程序预测BrGDH属于非跨膜蛋白，在第22-309 aa处含有保守的Aldo_ket_red结构域（图1A）。BrGDH蛋白与其他物种中GDH蛋白的系统发育关系分析表明单子叶和双子叶GDH蛋白被分成2个不同的分支。其中在单子叶分支中，BrGDH与非十字花科作物中的GDH蛋白亲缘关系较远，而BrGDH与AtGDH的亲缘关系最近（图1B），因此推测BrGDH可能与AtGDH具有相似的功能。
图1 BrGDH蛋白的氨基酸序列分析及与其他物种GDH蛋白的系统发育关系
2. BrGDH基因的组织表达模式
BrGDH基因在幼苗期和莲座期主要在根中表达，在结球初期和结球中期主要在叶肉中表达，在开花结荚初期主要在蕾和荚中表达，因此依据BrGDH具有时空表达特异性，推测其可能在不同的生长发育阶段中行使不同的功能。
图2 BrGDH的组织表达模式
3. BrGDH蛋白的亚细胞定位
将BrGDH在烟草中瞬时表达，结果发现亚细胞定位空载pRI101-GFP在整个细胞都表达，而pRI101-BrGDH-GFP所发的绿色荧光只在细胞膜和细胞核中存在，同时细胞膜和核膜上的绿色荧光与膜标签的红色荧光重合（图3），因此推测BrGDH蛋白在细胞膜和细胞核中行使功能。
图3 BrGDH在烟草细胞中的瞬时表达
4. BrGDH-异源表达拟南芥植株的阳性鉴定及BrGDH对AsA含量的影响
基于BrGDH-异源表达载体pTCK303-BrGDH，通过遗传转化获取T2代BrGDH-异源表达拟南芥植株。利用潮霉素抗性基因筛选T2代BrGDH-异源表达拟南芥植株，12个株系（OE1~OE12）均检测到潮霉素抗性基因（图4A）。β-葡萄糖醛酸酶（GUS）染色结果显示OE-1和OE-4株系叶片呈蓝色，而野生型植株并未呈现蓝色（图4B）。转基因和野生型拟南芥植株在表型上虽然无显著差异（图4C），但分析发现OE-1和OE4株系中BrGDH的表达量与AsA含量均显著高于野生型植株（图4D，图4E）。因此，我们推测BrGDH基因参与AsA的生物合成并起到关键作用。
图4 BrGDH异源表达拟南芥植株的阳性鉴定及AsA含量分析
5. Brddh-沉默大白菜植株中的AsA含量分析
利用VIGS技术获取Brddh-沉默大白菜植株。与野生型（WT）大白菜相比，Brddh-沉默大白菜植株（pTY-Brddh）和对照植株（pTY）的叶片在农杆菌侵染30天后出现明显的芜菁花叶病毒病症状（图5A）。检测BrGDH基因的表达水平与AsA含量，结果表明pTY-Brddh植株都小于pTY植株和WT植株（图5B，图5C）。进一步培养植株发现pTY-Brddh大白菜植株和pTY植株长势相对野生型植株变弱，且pTY-Brddh大白菜植株相对pTY植株出现早抽薹现象（图5D）。上述结果表明BrGDH基因参与AsA生物合成，而BrGDH部分沉默使植株更早进入生殖生长期。
图5 Brgdh-基因沉默大白菜植株的表型及AsA含量分析
6.BrGDH响应MeJA参与植株生长发育的分析
为了进一步分析BrGDH的生物学功能，本研究对BrGDH启动子的顺式作用元件进行预测分析。结果显示在起始密码子前第339~343 bp处含有MeJA响应元件（CGTCA）。为此，本研究对BrGDH-异源表达和野生型拟南芥植株进行不同浓度（0、50、100、200 umol/L）的MeJA处理。通过观察整个植株表型，结果发现随着MeJA浓度的增加，转基因和野生型植株的生长发育都逐渐受到抑制，如叶柄长、叶面积、主根长、地上部鲜重，然而转基因植株和野生型植株之间存在差异（图6A）。对结果进行分析，我们得知MeJA抑制植株的生长发育，而BrGDH可以减弱MeJA对植株生长发育的抑制作用。
图6 MeJA处理下，BrGDH对植株生长发育的影响分析
7.BrGDH响应MeJA参与植株叶片细胞膜的影响
为了进一步明确MeJA对植株叶片的损害程度及探索BrGDH响应MeJA参与逆境防御的作用，本研究观察植株叶片的颜色，结果发现当MeJA浓度大于50 μmol/L时，野生型植株叶片出现发紫症状，而BrGDH-异源表达拟南芥在MeJA浓度大于10 μmol/L时才开始出现发紫现象（图7A），这说明MeJA处理使植株花青素增加，且BrGDH减弱花青素的富集。植株叶片的台盼蓝染色结果发现随着MeJA处理浓度的增加，植株叶片变兰现象更加明显，且转基因植株相对野生型植株出现蓝色面积较小（图7B）。相对电导率结果显示MeJA使拟南芥植株电解液泄露程度增加，而BrGDH异源表达，抑制拟南芥植株的电解质泄露（图7C）。基于以上分析，我们推测MeJA使植株叶片的细胞膜受到损伤，而BrGDH减轻MeJA对细胞膜的伤害。通过测定植株叶片的抗氧化剂AsA的含量，研究发现随MeJA浓度的增加，BrGDH异源表达拟南芥中的AsA相对野生型植株大致呈现增加趋势（图7D），因此推测BrGDH可能通过增加AsA含量来抑制MeJA对叶片细胞膜的破坏作用。
图7 BrGDH响应MeJA对细胞膜的影响
8. 结论
抗坏血酸（AsA）作为抗氧化剂和辅酶因子参与多种功能。人体内缺乏AsA会导致坏血病和其他疾病，而适量的AsA有助于预防衰老、癌症和其他疾病。白菜是我国栽培面积最大的蔬菜，丰富的AsA含量可以满足人类的需求。鉴于不同白菜品种间AsA含量的巨大差异，研究白菜中AsA合成相关关键基因的功能至关重要。本研究克隆BrGDH基因的阅读框序列并分析其保守结构域和系统进化关系。在此基础上通过载体构建、瞬时转化和病毒诱导基因沉默等技术来分析BrGDH基因参与AsA合成的功能。结果表明，在拟南芥中BrGDH的异源表达提高了植物叶片中AsA的含量，而在白菜中BrGDH的部分沉默则降低了AsA的合成。MeJA抑制植物生长发育，降低AsA含量，破坏叶片细胞膜稳定性。然而，BrGDH似乎抵消了这些负面影响。这些发现有助于进一步了解大白菜AsA合成调控机理，为培育高AsA品种和提高植物抗逆性提供有价值的见解。
河南科技学院园艺园林学院袁敬平副教授为该论文第一作者，河南科技学院资源与环境学院申长卫副教授与河南科技学院园艺园林学院郭新磊讲师（内聘教授）为共通讯作者，其余主要作者包含硕士研究生孙博。该研究得到了国家自然科学基金项目（32102393；32472730；32402585）和河南省科技攻关项目（242102111143）的资助。
