免疫试剂是一种广泛应用于体外诊断的技术，通过特异性抗体与目标抗原的结合，实现对目标物质的快速检测。在免疫层析试剂的开发过程中，选择合适的二抗是至关重要的一步。二抗不仅直接影响检测的灵敏度和特异性，还关系到试剂的稳定性和可靠性。
二抗在免疫试剂中，它能够与一抗特异性结合，放大检测信号，从而提高检测的灵敏度和特异性。选择合适的二抗可以显著提升试剂的性能，确保检测结果的准确性和可靠性。反之，选择不当的二抗可能会导致假阳性、假阴性等问题，影响试剂的使用效果。
1、二抗选择的标准
1）一抗的动物来源：二抗必须能够识别一抗。因此，选择二抗时首先要考虑一抗的动物来源。例如，如果一抗是小鼠单克隆抗体，那么二抗必须选择抗小鼠的二抗（如山羊抗小鼠或兔抗小鼠）。同样，如果一抗来源于山羊，二抗必须选择抗山羊的二抗。
2）一抗的类别和亚类：一抗的类别和亚类也是选择二抗的重要依据。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。对于单克隆抗体，类别及亚类通常会在产品说明书中描述。例如，如果一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3），可以选择通用的抗小鼠IgG二抗，也可以选择专门针对某一亚类的二抗。
2、探针类型
二抗的探针类型决定了其在不同实验中的应用。常见的探针类型包括酶（如辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP）、荧光基团（如FITC、Rhodamine、Texas Red、PE等）、生物素和金颗粒。选择哪种探针的二抗主要取决于具体的实验需求。例如，Western Blot和ELISA实验中常用酶标二抗，而细胞或组织标记实验中通常使用荧光基团标记的二抗。
3、如何选择
为了减少二抗与样本的非特异性结合，可以选择经过血清吸附的二抗。例如，如果检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗可以选择经过人血清吸附的抗小鼠源二抗，以降低非特异性结合的风险。
4、具体操作步骤
1）确定一抗的动物来源和类别：首先，查阅一抗的产品说明书，确定其动物来源和类别。这是选择二抗的基础。
2）选择合适的二抗：根据一抗的动物来源和类别，选择相应的二抗。例如，如果一抗是小鼠IgG1，可以选择抗小鼠IgG1的二抗。
3）选择探针类型：根据实验需求，选择合适的探针类型。例如，如果进行Western Blot实验，可以选择酶标二抗；如果进行细胞免疫化学实验，可以选择荧光基团标记的二抗。
4）虑血清吸附：如果实验对特异性要求较高，可以选择经过血清吸附的二抗，以减少非特异性结合。
5）优化试剂浓度：确定最佳的二抗浓度，以获得最佳的灵敏度和特异性。可以通过梯度稀释实验，找到最佳的二抗浓度。
6）验证和优化：在初步选择二抗后，进行验证实验，评估其性能。如果性能不理想，可以调整二抗的种类或浓度，进行优化。
5、常见问题及解决方案
1）灵敏度低：用候选抗体检测赋值样本时灵敏度低，cut off值区间测不到。
解决方案：通过换用大粒径标记物，增加标记抗体和包被抗体的用量。如果采用竞争法测抗原，可以抗原用来标记，抗体用来包被，用独立质控系统。更换性能更好的抗体原料。
2）高值样本测不到：用候选抗体检测样本时高值样本测不到。
解决方案：考虑稀释样本后再测定。调整标记抗体和包被抗体的用量，设置梯度进行调试。换用小粒径的标记物，增加结合的抗体量。更换亲和性更好的抗体原料。
3）相关性指标差：用候选抗体检测已赋值的临床样本，相关性指标较差。
解决方案：确认样本来源及赋值数据的可靠性，样本是否新鲜。
筛选合适的阻断剂，减少干扰成分的影响。
4）存储问题：标记好的抗体封闭后放在储存液里，一两天后有沉淀。
解决方案：调整标记体系中的pH值，设置pH梯度进行调试。调整封闭剂的成分或用量，确保金颗粒或微球表面没有裸露位点。重新配制储存液，确保偶联的复合物稳定。
5）假阳性：阴性组用样本稀释液进行测试，T线出现假阳性。
解决方案：更换封闭剂成分或增加用量，减少非特异性结合。降低标记和包被抗体的用量，压低整体信号。增加离子浓度，或更换稀释液，改用其他体系进行尝试。
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