1、吖啶酯基本性质
化学结构与发光特性：吖啶酯是一类具有特殊化学结构的化合物，在化学结构上有产生发光的特有基团。它在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应。在碱性条件下被过氧化物酶氧化时，发出波长为470nm的光，其激发态产物N - 甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。吖啶酯具有较高的发光效率，这使得它在标记抗体后，能够在检测过程中产生较强的信号，便于检测低浓度的目标物质。
稳定性：在酸性溶液中（pH4.8），吖啶酯比较稳定，与蛋白质偶联物在室温下保存4周，其光量子产率不降低，冻干品在 - 20℃下，可以保存一年以上。然而，在碱性溶液中，由于部分发生水解降低了其稳定性，水解过程为不发光的暗反应过程；水解程度随pH增大而增大，随温度的升高而增大。吖啶酰胺稳定性高于吖啶酯结构，抗水解能力较强。并且吖啶环或酚环或苯磺酰环上连有甲基等给电基团时，由于空间位阻大，热稳定性增加；连有吸电子基团，有利于亲核取代反应而使其稳定性下降。
2、吖啶酯标记抗体的原理
反应基团相互作用：吖啶 - NHS酯（吖啶琥珀酰亚胺酯）能与蛋白质的一级氨基发生反应。在碱性条件下，NHS作为离去基团被取代，蛋白质与吖啶酯形成稳定的酰胺键。如果是不含 - NHS的吖啶羧酸则需要加入缩合剂EDCI等，才能与含胺基的蛋白发生偶联反应。对于吖啶酰肼，含有游离氨基，吖啶酰肼末端适用直接偶联含有醛基的多糖、核酸或者蛋白质等。
发光反应基础：其反应机理是在碱性条件下，过氧化氢与吖啶酯的9位碳原子发生加成，加成产物在碱性条件下形成的过氧负离子再亲核进攻羰基碳，离去基团离去并进一步形成不稳定的四元环中间体，开环后形成激发态的吖啶酮，其返回到基态的过程中释放出光子[3]。这种发光反应不需要酶的催化，直接由吖啶酯与过氧化物在碱性环境下发生反应，这使得发光反应迅速且高效。
3、吖啶酯标记抗体过程
试剂准备：首先要准备好高纯度的吖啶酯试剂，如吖啶酯DMAE - NHS、吖啶酯NSP - DMAE - NHS等。溶解吖啶琥珀酰亚胺酯时，使用的DMF必须严格无水，防止吖啶酯水解，不使用时，要干燥密封 - 20℃保存。同时，要准备好待标记的抗体溶液，抗体应具有较高的纯度和活性。
反应环境准备：由于反应在碱性条件下进行，需要准备合适的碱性缓冲液来调节反应体系的pH值。一般选择pH值在适宜范围内的缓冲液，既能保证反应的进行，又能尽量减少吖啶酯的水解。
标记反应：将适量的吖啶酯加入到抗体溶液中，根据抗体的量和标记的要求确定吖啶酯的用量。在碱性缓冲液的环境下，使吖啶酯与抗体上的一级氨基发生反应。如果使用的是吖啶 - NHS酯，反应过程中NHS作为离去基团被取代，从而形成稳定的酰胺键连接吖啶酯和抗体。在反应过程中，要注意控制反应的温度和时间。一般来说，反应温度可以选择在室温或者稍高一点的温度，但要避免温度过高导致吖啶酯水解或者抗体失活。反应时间根据反应的规模和具体的实验条件而定。
后处理：去除未反应的吖啶酯，反应完成后，反应体系中会存在多余的吖啶酯，需要将其除去。对于吖啶 - NHS酯标记的情况，可以通过脱盐柱除去多余的吖啶盐。这样可以避免未反应的吖啶酯在后续的检测过程中产生干扰信号。
保存标记后的抗体：标记后的抗体要选择合适的保存条件。由于吖啶酯标记的抗体在碱性和氧化环境下均不稳定，易分解，发光标记物在光照条件下有可能部分分解，以致影响发光效果，所以建议偶联后保存用的缓冲液尽量用弱酸性的缓冲液，鼓氮气除去其中的氧气，密封避光低温保存。有条件的可以制成冻干样再保存。
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