1. HEK 293细胞概述
1.1 细胞特性
生长特性：HEK 293细胞通常以贴壁生长方式培养，形态扁平，直径在11-15µm之间。它们也可以在悬浮培养条件下生长，此时细胞呈圆形。
遗传特性：HEK 293细胞是亚三倍体，具有64条染色体和三个X染色体拷贝。此外，细胞基因组整合了约4 kbp的腺病毒5型基因组片段，主要位于19号染色体上。
适应性：HEK 293细胞适应于多种培养基，包括Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）和DMEM培养基，通常添加10%胎牛血清（FBS）以及L-谷氨酰胺等营养成分。它们在37℃、5% CO2的条件下生长良好，pH值在6.9-7.1时可顺利贴壁生长。
转染效率：HEK 293细胞容易转染，常用的转染方法包括磷酸钙共沉淀法、脂质体介导转染和电穿孔等，转染效率可达90%以上。这使得它们成为基因功能研究和蛋白表达的理想工具。
1.2 应用领域
基因功能研究：由于HEK 293细胞易于转染，研究人员可以将目标基因导入细胞，研究其功能和调控机制。例如，通过过表达或敲除特定基因，观察细胞表型的变化，从而揭示基因在细胞生长、分化和信号传导中的作用。
蛋白表达与生产：HEK 293细胞能够高效表达外源蛋白，常用于生产重组蛋白，如单克隆抗体、细胞因子和酶等。其人类细胞系的背景使得生产的蛋白在结构和功能上更接近天然人类蛋白，具有较高的生物活性和稳定性。
病毒载体生产：HEK 293细胞广泛用于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒等病毒载体的生产。这些病毒载体在基因治疗、疫苗开发和基因功能研究中具有重要应用。例如，在新冠疫苗的开发中，HEK 293细胞被用于生产病毒载体，以实现病毒基因的递送和表达。
药物筛选与毒性测试：HEK 293细胞可用于药物筛选和毒性测试，通过将细胞暴露于不同药物或化合物中，评估其对细胞生长、代谢和基因表达的影响，从而筛选出具有潜在治疗效果的药物或评估药物的安全性。
细胞信号传导研究：HEK 293细胞在细胞信号传导研究中也有广泛应用。研究人员可以利用该细胞系研究细胞表面受体与信号分子的相互作用，以及信号在细胞内的传递途径和调控机制。例如，通过转染特定的受体基因，研究其在细胞信号传导中的作用和信号通路的激活情况。
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2. 细胞培养方法
2.1 培养基与条件
2.2 细胞传代技术
3. 细胞培养注意事项
3.1 无菌操作
3.2 培养条件维持
4. 常见问题及解决策略
4.1 细胞贴壁问题
培养基pH值不适宜：HEK 293细胞适应的pH值范围为6.9-7.1，pH值过高或过低都会影响细胞的贴壁能力。解决方法是定期监测培养基的pH值，必要时进行调整。可以使用预调pH值的培养基，或者在培养基中添加适量的碳酸氢钠以维持pH值稳定。 培养瓶表面处理不当：培养瓶表面如果过于光滑或存在污染，会影响细胞的贴壁。解决方法是使用经过包被的培养瓶，如预先涂覆一层多聚赖氨酸、明胶或鼠尾胶原等物质，以增加表面粗糙度和细胞附着力。此外，确保培养瓶在使用前经过严格的消毒和灭菌处理，避免污染。 消化过度：在传代过程中，如果胰蛋白酶-EDTA消化时间过长或浓度过高，会导致细胞消化过度，从而影响细胞的贴壁能力。解决方法是严格控制消化时间和消化液浓度，建议在显微镜下密切观察细胞消化情况，一旦细胞变圆并开始脱落，立即终止消化。 接种密度不当：接种密度过低会导致细胞难以贴壁和生长，而密度过高则会导致细胞聚集和竞争营养。解决方法是根据细胞的生长状态和实验需求，合理调整接种密度。一般建议的接种密度为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²。
4.2 细胞污染预防
严格无菌操作：在整个细胞培养过程中，必须严格遵守无菌操作规程。操作前，对所有器具和试剂进行严格的消毒和灭菌处理，如使用高压蒸汽灭菌、过滤除菌等方法。操作时应在生物安全柜内进行，避免快速移动和交谈，以减少空气流动和污染风险。 定期更换培养基：及时更换新鲜培养基可以有效清除培养基中的代谢废物和潜在污染物。通常每2-3天换液一次，换液时要轻柔操作，避免对细胞造成机械损伤。 使用抗生素：在培养基中添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素，可以有效抑制细菌和真菌的生长，预防细胞污染。但需注意抗生素的使用浓度不宜过高，以免对细胞产生毒性作用。 定期监测细胞状态：定期观察细胞的生长情况和形态变化，及时发现异常现象。如果发现细胞出现污染迹象，如培养基变浑浊、细胞形态异常、生长缓慢等，应立即采取措施进行处理。可以使用显微镜观察细胞是否有微生物污染，必要时进行细菌、真菌和支原体检测。 培养箱和操作台面清洁：保持培养箱和操作台面的清洁，定期进行消毒处理。培养箱内的水盘要定期更换水，避免细菌滋生。操作台面在使用前后要用70%酒精擦拭消毒。
5. 细胞冻存与复苏
5.1 冻存步骤
细胞准备：选择处于对数生长期的健康细胞进行冻存，此时细胞生长旺盛，冻存后复苏成功率较高。当细胞融合率达到80%-90%时，进行传代培养，待细胞生长良好后，方可进行冻存操作。 消化收集细胞：使用0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液对细胞进行消化。将消化液加入培养瓶中，轻轻摇晃使消化液均匀覆盖细胞表面，然后将培养瓶放入37℃培养箱中消化2-3分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速拿回操作台，加入适量的完全培养基终止消化。轻轻吹打培养瓶，使细胞完全脱落并形成单细胞悬液。 离心收集细胞沉淀：将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集下层细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 制备冻存液：冻存液的配制是关键步骤之一。常用的冻存液配方为70%的完全培养基+20%胎牛血清（FBS）+10%二甲基亚砜（DMSO）。DMSO是一种常用的细胞冻存保护剂，能够有效防止细胞内冰晶的形成，减少冻存过程中对细胞的损伤。配制时需注意DMSO的加入方式，应缓慢滴加，边滴边轻轻摇晃，以确保其均匀混合。 重悬细胞：向离心管中加入适量的冻存液，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率，一般细胞浓度为2-5×10^6 cells/mL较适宜。重悬时动作要轻柔，避免产生气泡，确保细胞均匀分散在冻存液中。 分装冻存：将重悬好的细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管分装1-1.5 mL。分装时要避免气泡的产生，可采用边分装边轻轻摇晃的方式，使细胞悬液均匀分布。在冻存管上做好标记，注明细胞名称、冻存日期、细胞浓度等信息，以便于后续管理和使用。 程序降温：将冻存管放入程序降温仪中进行缓慢降温。降温程序一般为：先在4℃下放置30分钟，然后在-20℃下放置1小时，最后在-80℃下过夜。缓慢降温有助于细胞逐渐适应低温环境，减少冰晶的形成，提高细胞的存活率。 液氮保存：降温完成后，将冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速放入液氮罐中长期保存。液氮温度极低，能够长期保持细胞的活性和稳定性。在液氮保存过程中，需定期检查液氮罐的液氮量，确保冻存管始终处于液氮环境中。
5.2 复苏操作
准备工作：提前将水浴锅预热至37℃，并准备好无菌的离心管、培养皿、移液管等实验器具。同时，将完全培养基在37℃培养箱中预热，以备后续使用。 快速融化：从液氮罐中取出冻存管，迅速将其投入37℃水浴锅中，轻轻摇动，使冻存管内的细胞悬液快速融化。整个融化过程应在1-2分钟内完成，以避免细胞在融化过程中受到损伤。 稀释细胞：将融化的细胞悬液吸出，加入到含有预热完全培养基的离心管中，轻轻混匀。通常情况下，将1 mL的细胞悬液加入到9 mL的完全培养基中进行稀释，以降低DMSO的浓度，减轻其对细胞的毒性。 离心收集细胞：将稀释后的细胞悬液以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。离心时注意转速和时间的控制，避免对细胞造成损伤。 重悬接种：用适量的完全培养基重悬细胞沉淀，制成均匀的细胞悬液。将细胞悬液接种到预先准备好的培养皿中，轻轻摇晃使细胞均匀分布。接种密度一般为1×10^4-5×10^4个细胞/cm²，根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。 培养观察：将接种好的培养皿放入37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。在细胞复苏后的24小时内，尽量减少对培养皿的移动和观察，以免影响细胞的贴壁和生长。在随后的培养过程中，定期观察细胞的生长情况，及时更换新鲜培养基，通常每2-3天换液一次。 评估复苏效果：通过显微镜观察细胞的形态、生长状态和密度，评估细胞的复苏效果。健康的复苏细胞应贴壁生长良好，形态正常，无明显的污染迹象。若发现细胞生长异常或污染，需及时采取相应措施进行处理。
6. 细胞培养优化技巧
6.1 提高细胞活性
优化培养基成分
添加氨基酸和维生素：在培养基中添加非必需氨基酸和维生素，如谷氨酰胺、丙酮酸钠、维生素C和维生素E等，可以促进细胞生长和代谢，提高细胞活性。例如，谷氨酰胺是细胞生长的重要氮源，添加2 mM的L-谷氨酰胺可显著提高细胞活性。 使用胎牛血清替代品：胎牛血清（FBS）是培养基中常用的添加物，但其成分复杂且批次间差异较大。使用经过优化的胎牛血清替代品，如无血清培养基添加剂，可以提供更稳定的生长环境，提高细胞活性。
改善培养条件
控制温度和CO2浓度：HEK 293细胞最适宜的生长温度为37℃，CO2浓度为5%。使用精确控制温度和CO2浓度的培养箱，可以维持稳定的培养环境，有利于细胞的生长和活性维持。 调节pH值：培养基的pH值对细胞活性有重要影响。使用缓冲体系，如HEPES缓冲液，可以维持培养基的pH值在6.9-7.1范围内，从而提高细胞活性。
采用细胞保护剂
抗氧化剂：在培养基中添加抗氧化剂，如谷胱甘肽、维生素C和维生素E等，可以清除细胞内的活性氧（ROS），减少氧化应激对细胞的损伤，提高细胞活性。 细胞凋亡抑制剂：使用细胞凋亡抑制剂，如Z-VAD-FMK等，可以阻断细胞凋亡途径，减少细胞死亡，提高细胞活性。
定期传代和细胞计数
定期传代：细胞在培养过程中会逐渐衰老，定期传代可以去除衰老和死亡的细胞，保持细胞群体的年轻和活力。一般建议每2-3天进行一次传代。 细胞计数：在传代和实验操作前，进行准确的细胞计数，以确保细胞密度适宜，避免细胞过度拥挤或稀疏，从而维持细胞的正常生长和活性。
6.2 提升转染效率
选择合适的转染方法
脂质体介导转染：使用脂质体介导的转染试剂，如Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000，可以高效地将核酸导入HEK 293细胞。这些试剂通过形成脂质体-核酸复合物，促进细胞内吞作用，提高转染效率。 电穿孔转染：电穿孔转染通过短暂的高电压脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使核酸更容易进入细胞。这种方法适用于较难转染的细胞类型，但对细胞有一定的损伤，需优化电穿孔参数。
优化转染试剂和核酸的用量
调整转染试剂和核酸的比例：不同的细胞类型和实验需求可能需要不同的转染试剂和核酸用量。通过实验优化，找到最佳的转染试剂和核酸的比例，可以显著提高转染效率。例如，对于HEK 293细胞，常用的转染试剂和质粒DNA的比例为3:1。 核酸的纯度和质量：确保所使用的核酸纯度高、无污染，且具有良好的超螺旋结构。核酸的质量直接影响转染效率，使用高质量的核酸可以提高转染的成功率。
优化细胞状态和密度
细胞状态：选择处于对数生长期的健康细胞进行转染，此时细胞生长旺盛，转染效率较高。避免使用处于静止期或衰老期的细胞。 细胞密度：在转染前，将细胞密度控制在50%-80%之间。过低的细胞密度可能导致转染效率低，而过高的细胞密度则可能影响细胞的生长和转染效果。
使用细胞转染增强剂
转染增强剂：使用细胞转染增强剂，如聚乙烯亚胺（PEI）等，可以提高转染效率。这些增强剂通过与核酸结合，形成稳定的复合物，促进细胞内吞作用，增加核酸在细胞内的摄取。
优化转染操作步骤
转染复合物的制备：在制备转染复合物时，需严格按照试剂说明书进行操作，确保核酸和转染试剂充分混合。混合后需静置一段时间，使复合物充分形成。 转染后培养条件的调整：转染后，适当调整培养条件，如降低培养基中的血清浓度或添加抗生素，可以提高转染效率和细胞的稳定性。
