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circRNA 原液制备涉及 3 个主要过程：合成、纯化及质量分析。除 circRNA 之外，环化反应产物中还存在其他杂质 RNA，包括线性前体Precusor RNA，Nicked RNA，切除的内含子等，这给 circRNA 的分离纯化和鉴定分析带来巨大的挑战性。2025 年 1 月 4 日，丹麦奥胡斯大学跨学科纳米科学中心 （iNANO）Jorgen Kjems 团队的博士生 Yanyi Jiang 在 bioRxiv 上传预印本文章：RNA denaturation underlies circular RNA separation，他们证实凝胶电泳和 SEC-HPLC 能否成功分离 circRNA 和相同长度的线性RNA取决于是否对样品进行上样的预变性处理。2024 年 12 月 13 日，MRC 分子生物学实验室（MRC-LMB）Venki Ramakrishnan 团队在 Nature Biomedical Engineering 发表文章：Efficient circular RNA synthesis for potent rolling circle translation，他们发现天然琼脂糖凝胶可成功分离 circRNA 和其对应的线性 Nicked RNA，并且，加入变性剂尿素或者甲酰胺后可增强 circRNA 分离效率。因此，本期内容，我们综合两篇论文的研究结果，为大家梳理 RNA 变性如何影响circRNA和线性RNA(Precusor 和 Nicked)凝胶电泳迁移速率。凝胶电泳（Gel electrophoresis）是分离鉴定 circRNA 最为广泛应用的方法。根据凝胶基质类型的不同，可划分为:琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis,AGE)
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)
毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis,CGE)。
琼脂糖凝胶电泳分为两种：自制琼脂糖凝胶和 Invitrogen 商业化预制琼脂糖胶 E-Gel。预制琼脂糖胶 E-Gel 又分为两种：E-Gel 预制琼脂糖凝胶（含 SYBR Safe DNA 凝胶染料）和 E-Gel EX 预制琼脂糖凝胶（SYBR Gold II DNA 凝胶染料）。
在 0.8%天然琼脂糖凝胶上，Venki Ramakrishnan 等人电泳分离 TRIC 环化策略的共环化合成产物 V1.0 EGFP。在 circEGFP 分子大小对应位置附近总是看到两条不同的电泳条带，均表现耐受 RNase R 降解。胶回收 lower bands，加入 RNase H 处理。有意思的是，RNase H 处理样品的电泳条带中出现一条同 upper bands 位置相似的电泳条带。这说明 upper bands 是 Nicked EGFP，而 lower bands 是 circEGFP。加入 RNase H 后，circEGFP 降解为 Nicked RNA。换句话说，在 0.8%的天然琼脂糖凝胶上，circEGFP 要比 Nicked EGFP 迁移速度更快。
此外，Venki Ramakrishnan 等人发现 circRNA 长度与琼脂糖凝胶浓度会影响分离效率。在 0.8%的天然琼脂糖凝胶上，对于 P2A-EGFP(no EGFP,813nt)、Fluc(2601nt)及 EGFP 来说，各自对应的 circRNA 电泳条带均位于 Nicked RNA 下方。对于 Spike(约 4000nt）来说，其对应的 circRNA 和 Nicked RNA 电泳条带发生大部分重叠。有趣的是，对于 Cas9（约 5757nt）来说，circRNA 电泳条带反而出现在前体 Precusor RNA 电泳条带的上方。类似的是，在 1.5%琼脂糖凝胶上，对于 Spike 来说，circRNA 电泳条带也开始出现在前体 Precusor RNA 电泳条带的上方。随着琼脂糖凝胶浓度从 0.8%增加至 1.5%，对 circRNA 迁移速率降低程度要超过 Nicked RNA。当琼脂糖浓度增加至 3%时，几乎所有待测 circRNA 迁移速率均明显要比 Nicked RNA 更缓慢，circRNA 电泳条带位于 Nicked RNA 电泳条带上方。
Venki Ramakrishnan 等人发现，在甲酰胺-1.5%琼脂糖凝胶中，对于 Spike 和 Cas9 来说，各自对应的 circRNA 和 Nicked RNA 可分离开来。由于甲酰胺毒性太强，用尿素替换甲酰胺。在 6M 尿素-1.5%琼脂糖凝胶中，所有测试 circRNA 迁移速度均比 Nicked RNA 缓慢，两者电泳条带间距明显。降低尿素或者琼脂糖浓度、减少电泳时间或者电压均会降低 circRNA 与 Nicked RNA 分离效率，使得两者的电泳条带间距明显缩短。
Jorgen Kjems 等人采用 3 种不同的环化策略（T4 RNA Ligase、PIE 及 STS），构建了两种 circRNA：一种编码 EGFP 荧光蛋白，另外一种是没有翻译元件的小型环状 RNA。不同的环化策略对应不同的环化反应产物。在 T4 RNA Ligase 环化反应产物中，未反应的线性前体 Precusor RNA 与 circRNA 拥有相同长度，而在基于核酶的 PIE 或者 STS 环化反应产物中，线性前体 Precusor RNA 序列要比 circRNA 更长，此外，还存在切除的内含子、剪接中间体及线性或者环状的高分子量串联 RNA（HMW）。在所有策略的环化反应中存在一种共同的、无可避免的杂质—Nicked RNA，它的序列长度可能同 circRNA 一样，也可能因发生多次断裂而变得更短。
不同环化策略反应产生不同的副产物 RNA
Jorgen Kjems 等人发现，在 1% 琼脂糖凝胶中，相同长度的环状 T4lig2-CVB-GFP-circRNA（对 RNase R 降解耐受） 和线性 T4lig2-CVB-GFP-Precusor RNA（对 RNase R 降解敏感）无法分开，电泳条带只有一条。在 2%琼脂糖凝胶中，尽管延长电泳时间（30/40/60min），但是，环状 CVB-GFP-circRNA 和线性T4lig2-CVB-GFP前体RNA或者CVB-GFP-Nicked RNA 电泳条带仍然相距极近，分辨率极低。
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在旧文：探寻 circRNA 漂浮不定的电泳迁移速率背后的原因，我们曾介绍过 Howard Y Chang 和 Daneil.G.Adernson 等人发现在 Thermo Fisher 预制胶 E-Gel EX 电泳系统中，circRNA 在电泳胶图中呈现的表观 Size 远超过其实际 Size，电泳条带分布：circRNA>Precusor RNA> Nicked RNA。而且，在 E-Gel EX 电泳系统中，circRNA 迁移速率会受到上样缓冲液组成，染料，电压的影响。Jorgen Kjems 使用 EX 1-2%电泳程序，电泳时间为 20min，2% E -Gel EX 和 2% E -Gel (non-EX)可将 circRNA 和线性 RNA(相同长度)分离开来（circRNA 电泳条带在上面，线性 RNA 电泳条带在下面），而 1% E -Gel (non-EX)无法将 circRNA 和线性 RNA 分离开来。使用 non-EX 0.8%-2%电泳程序，2% E -Gel EX 和 2% E -Gel (non-EX)可将 circRNA 和线性 RNA 分离开来，但是分辨率很差。对于 2% E -Gel (non-EX)来说，还需要将电泳时间延长至 40min，才能将 circRNA 和线性 RNA 分离开来。
特别需要注意的是，电泳完成后，不同类型的 E-Gel 和电泳程序导致的凝胶温度是不相同的。采用 EX 1-2%电泳程序，电泳时间为 20min，E -Gel EX 和 E -Gel (non-EX) 凝胶温度均达到 80℃以上，而采用 non-EX 0.8%-2%电泳程序，电泳时间为 24-40min，E -Gel EX 和 E -Gel (non-EX) 凝胶温度仅达到 55℃。上述现象似乎说明较高的温度有助于 circRNA 与线性 RNA(相同长度) 的分离。
在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，circRNA 要比线性 RNA 迁移速度缓慢，处于胶图上方位置。相反，在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳中，circRNA 迁移速度接近或者超过线性 RNA。Jorgen Kjems 采用未用 T4 Ligase 处理的 T4lig2-origami 作为线性 RNA 对照，其对 RNase R 降解耐受。电泳样品为包含 circRNA 和线性 RNA 的不同环化反应产物。改变电泳条件，观察 circRNA 与线性 RNA(相同长度) 的分离效率变化.在 3.5%天然 PAGE 电泳中，电泳温度为 4℃时（condition 1）：环形 T4lig2-origami 要比线性前体 T4lig2-origam 迁移速度更快，这与以前的研究结果相符合；环形 CVB3-GFP-circRNA 与线性 RNA 分离效果极差，基于核酶策略的 3 种环形 CVB3-GFP-circRNA 均呈现弥散样。在 3.5%天然 PAGE 电泳中，电泳温度为室温时（condition 2）：circRNA 迁移速度要比线性 RNA 更加缓慢，两者电泳条带的间距明显拉开。保持上述电泳条件不变，在上样前，对样品进行变性前处理（condition 3）：加入 2×RNA Loading Dye (含 95%甲酰胺)，90℃加热变性 2min，快速冷却。该样品的变性前处理使得 circRNA 分辨率得到进一步提升。在 7.5M 尿素变性 PAGE+室温+样品变性前处理条件下（condition 4），circRNA 迁移速度变得非常缓慢，circRNA 电泳条带和线性 RNA 电泳条带之间的间距非常大，原本在天然 PAGE 中出现的弥散条带变为细峰。上述现象充分说明 RNA 变性处理可以极大改善 circRNA 与线性 RNA 分离效率。接下来，Jorgen Kjems测定在变性 PAGE 中，不同凝胶浓度对 circRNA 分离效率的影响。将凝胶浓度从 4%降低至 2.5%会明显降低 circRNA 分离效率，使得 circRNA 电泳条带与线性 RNA 电泳条带之间的间距缩小。在 2.5%变性 PAGE 中，STS 环化反应合成的 circRNA 迁移速度居然超过了线性 RNA。因此，考虑到电泳时间和分离效率，研究人员选择 3.5%变性 PAGE 作为后续 STS 环化反应产物和 PIE 环化反应产物的分离鉴定条件。![]()
Jorgen Kjems等人想知道样品变性前处理（加入 2×RNA Loading Dye(含 95%甲酰胺)，65℃加热变性 2min，快速冷却）是否会对circRNA和相同长度的线性RNA在毛细管凝胶电泳上的分类效果造成影响。T4lig2-origami 和 T4lig2-CVB3-EGFP 的环形 RNA 和线性 RNA 前体的序列长度一样，当对环化反应产物不做变性处理时，无法将环形 RNA 和相同长度的线性 RNA 前体分离开来。然而，一旦对环化反应产物做上样前的变性处理，那么 T4lig2-origami 的 circRNA 要比线性 RNA 前体迁移速度更快一点，两种 RNA 的电泳条带之间存在间距。对于 PIE 和 STS 环化反应产物说，不做变性处理，circRNA 迁移速率更快，只是上样前的变性处理会使得 circRNA 和相同长度的线性 RNA 在毛细管凝胶电泳上的电泳条带更加紧凑，减弱弥散状态。![]()
在非变性条件下，分子内的氢键作用，RNA 分子拥有非常复杂的结构。在凝胶电泳时，带负电荷的 RNA 分子在电场作用下穿越凝胶基质。不同形状和水合直径的 RNA 分子在凝胶基质中的滞留程度和迁移速率不同。一方面，在基于I型内含子的PIE/STS/TRI环化反应产物中，线性前体Precusor RNA序列要比circRNA更长，因此，circRNA迁移速率更快，两者电泳条带间距非常明显。另外一方面，非变性的 circRNA 和 Nicked RNA 具有相似的水合直径，因此很难在天然凝胶中将两者完全分离开来。然而，由于 circRNA 具有更加致密的结构，因此，在凝胶电泳中，circRNA 迁移速率只是比对应的、相同长度的线性 Nicked RNA 稍快一点点。![]()
在变性条件下，例如高温、甲酰胺及尿素，氢键断裂造成 RNA 分子的复杂结构打开。在变性凝胶电泳条件，线性 RNA 可能被迫采取一种延伸的单链构型，从而允许其蜿蜒向前穿越凝胶孔隙。相反，circRNA 仍旧保持环状 Loop 结构，使得其穿越凝胶孔隙摩擦力增加（在行为上，类似于未配对的双链 RNA 分子），相比对应的线性 RNA 分子，电泳迁移速率变更慢。此外，在变性凝胶条件下，circRNA迁移速率也明显比序列更长的前体Precusor RNA更加缓慢。E-Gel 凝胶是商业化的预制胶，其具体成分未披露。在 E-Gel 凝胶系统中，高温会变性 RNA 分子，从而促进 circRNA 分离。除了分子结构状态，circRNA 自身的大小也会直接影响其在凝胶中的分离效率，例如，在 12%-18%的尿素变性 PAGE 电泳中，小 circRNA 分子（10-25nt）要比对应的线性 RNA 分子迁移速度更快。琼脂或者聚丙烯酰胺的浓度会强烈影响凝胶基质的筛分能力。对于 1%琼脂糖凝胶来说，无论是自制的，还是 E-Gel 预制凝胶，相同长度的线性 CVB3-GFP-RNA 和环状 CVB3-GFP-circRNA 电泳条带重叠在一起，无法区分，这可能是由于凝胶孔径过大阻碍 RNA 分子采取单链延伸构型穿越凝胶基质，从而降低 circRNA 分离效率。总结来说，circRNA和线性RNA在凝胶电泳中的分离效率是RNA本身性质（构型和大小）和凝胶基质筛分能力相互作用的结果。
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