中文摘要
目的 对自制的兔源5型肺炎球菌特异性血清参考品进行质量控制检测，用于23价肺炎球菌多糖疫苗生产过程中的过程样品检测。
方法 采用双光径速率浊度免疫分析系统非竞争性浊度模式进行检测，依次考察5型血清的工作浓度及线性、交叉情况、与市售血清的可比性、室间室内检测差异以及工作浓度下的稳定性。
结果 4批自制5型血清工作浓度最大稀释倍数分别为75、20、30、8倍，对应工作浓度下，多糖浓度在0.625~4.000 μg/ml范围内与响应值呈现良好线性关系，线性相关系数均＞0.985；4批5型血清参考品与其余22个型别均无交叉现象，特异性良好；与市售血清的可比性考察中，5批血清（包括市售血清）同时检测3个不同厂家上市疫苗中的5型多糖含量的变异系数均小于5%，4批自制5型血清与市售血清重均分子量降低后的检测结果无明显差异；室间、室内检测结果变异系数均＜10%；工作浓度的4批5型血清在2~8 ℃均可在至少1个月内保持良好稳定性。
结论 自制的兔源5型肺炎特异性血清效价高、线性良好、无交叉，与市售血清具有可比性，工作浓度下稳定性良好，可用于肺炎5型多糖疫苗的多糖含量检测。
正文
23价肺炎球菌多糖疫苗是将23种最广泛流行、最具侵袭性的血清型肺炎球菌进行培养、提纯后制成的多糖疫苗。该疫苗成品为无色透明的注射液，临床用于预防2岁以上易感人群由肺炎球菌引起的疾病。
荚膜是肺炎球菌的重要毒力因子，其主要成分是荚膜多糖。检测多糖含量是23价肺炎球菌多糖疫苗效力评价的有效手段。目前，市售肺炎疫苗的多糖含量检测均采用速率比浊法，检测所用血清为市售进口5型肺炎球菌血清，价格高昂。本研究拟通过对自制的4批兔源5型肺炎球菌特异性血清（兔源5型血清）进行相关质量控制检测，为其应用于23价肺炎球菌多糖疫苗生产过程中的过程样品检测提供依据，从而减少肺炎疫苗多糖含量检测对进口血清的依赖，降低检测成本。
1
材料与方法
1.1
血清与多糖
待进行质量控制检测的4批兔源5型血清（批号：388、394、418、430），1.2 ml/支，-70 ℃保存；1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌多糖参考品（批号分别为1T-BZ20180901、2T-BZ20181001、3T-BZ20190101、4T-BZ20180901、5T-BZ20180901、6BT-BZ20180901、7FT-BZ20180901、8T-BZ20180901、9NT-BZ20180901、9VT-BZ20180901、10AT-BZ20181101、11AT-BZ20180901、12FT-BZ20180901、14T-BZ20181001、15BT-BZ20180901、17FT-BZ20180901、18CT-BZ20181101、19AT-BZ20181101、19FT-BZ20181101、20T-BZ20180901、22FT-BZ20180901、23FT-BZ20180901、33FT-BZ20180901），质量浓度均为500 μg/ml，-70 ℃保存；5型精制多糖（批号：SP5JZ20191124、SP5JZ20210102、SP5JZ20210105、SP5JZ20210206），均由成都生物制品研究所有限责任公司（成都公司）提供；5型市售血清（批号：Z511V3）购自丹麦国立血清研究所；3批上市23价肺炎球菌多糖疫苗分别由厂家1、2、3提供。
1.2
仪器及试剂
3台IMMAGE 800双光径速率浊度免疫分析系统购自贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司，分别位于成都公司细菌性疫苗二室、细菌性疫苗研究室和质量检定室。
UDR试剂盒、IMMAGE Buffer 1缓冲液、IMMAGE Diluent 1稀释液，均购自美国贝克曼库尔特公司。
微流化仪（NanoGenizer-II）购自苏州微流纳米生物技术有限公司。
1.3
检测方法
多糖检测：采用双光径速率浊度免疫分析系统的非竞争性浊度模式进行检测，样品体积20 μl、血清反应体积23 μl、缓冲液（Buffer 1）体积300 μl，增益倍数4，稀释比例1:1，反应时间2.5 min。
1.4
兔源5型血清工作浓度确定及线性考察
兔源5型血清的线性考察与其工作浓度的确定同时进行。
将兔源5型血清进行适当稀释，5型多糖参考品根据其多糖含量进行梯度稀释，各点梯度为0.625、1.250、2.000、2.500、4.000 μg/ml，以下简称线性考察梯度。平行测定3次5型肺炎球菌多糖参考品各梯度浓度响应值，以各点响应值均值与线性考察梯度浓度绘制曲线并进行线性拟合，计算线性相关系数（r）。根据首次稀释梯度的结果，适当放大或缩小稀释倍数，使r尽可能接近1。血清适当稀释后再次测定线性考察梯度各点响应值，进行线性拟合，计算线性r，直至确定出良好线性条件下的血清工作浓度最大稀释倍数。
1.5
交叉检验
兔源5型血清的稀释按照1.4中确定的工作浓度最大稀释倍数，使用稀释液Diluent 1稀释。根据1、2、3、4、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎球菌多糖参考品多糖含量，分别配制多糖含量为2.3 μg/ml的单型样品，作为单型阴性样品。此外配制除5型以外22个型别的混合样品，各型多糖含量均为2.3 μg/ml，作为混合阴性样品。各样品分别与稀释好的5型血清按照1.3中条件反应，测定响应值。阴性样品响应值与1.4中0.625 μg/ml浓度的响应值的1/2作比较，当阴性样品响应值小于该值时，认为血清不存在交叉现象，否则认为存在交叉现象。
1.6
与市售血清的可比性考察
参照1.3中的条件及1.4中确定的4批5型血清稀释倍数，按照标准曲线范围0.625、1.250、2.000、2.500 μg/ml定标，5型市售血清按同样条件进行定标。
4批5型血清和市售血清对不同相对分子量5型多糖反应程度的可比性考察：将5型精制多糖SP5JZ20191124配制成质量浓度1 mg/ml的溶液，使用微流化仪在34.47 MPa压力下进行循环打断，分别在0、1、3次取样。所取样品分别进行重均分子量、多糖含量检测，绘制趋势图，考察二者是否具有可比性。
不同厂家多糖含量检测可比性考察：分别取厂家1、厂家2、厂家3疫苗各1批，稀释至合适浓度，依据上述检测程序进行5型多糖含量检测，计算变异系数（coefficient of variation，CV）。合格标准：CV≤15%。
1.7
室间、室内精密度检测
参照1.3中条件及1.4中确定的4批兔源5型血清稀释倍数，按照标准曲线范围0.625、1.250、2.000、2.500 μg/ml分别在细菌性疫苗研究室、质量检定室、细菌性疫苗二室进行双光径速率浊度免疫分析系统定标。将SP5JZ20210102、SP5JZ20210105、SP5JZ20210206批次的精制多糖样品稀释至合理浓度范围内，并进行室间、室内精密度检测，计算检测结果CV值。合格标准：CV≤15%。
1.8
稳定性考察
将多糖参考品（5T-BZ20180901）根据其多糖含量进行0.625、1.250、2.000、2.500 μg/ml梯度稀释。将4批兔源5型血清稀释至工作浓度后，平行测定各点响应值2次，绘制标准曲线，计算决定系数，以各点均值及决定系数作为稳定性0时间点参考值。剩余工作浓度血清保存于2~8 ℃冰箱，每隔7 d用同样的方法绘制标准曲线，计算决定系数。以各时间点与0时间点对应浓度下的平均响应值计算CV值，同时参考各时间点决定系数。合格标准：CV≤15%。
2
结果
2.1
兔源5型血清工作浓度确定及线性考察
依据1.4中不同稀释倍数下血清与线性考察梯度浓度中各点多糖的响应值，确定了4批兔源5型血清的工作浓度最大稀释倍数，均表现出了良好的线性关系，线性r均＞0.985。结果见表1。
2.2
交叉检验
测定单型阴性样品及混合阴性样品与兔源5型血清的响应值，其结果均小于2.1中4批血清线性考察梯度最低点（0.625 μg/ml）处响应值的1/2。表明这4批兔源5型血清与其余22个型别不存在交叉现象，特异性良好。结果见表2。
2.3
与市售血清的可比性考察
5型精制多糖SP5JZ20191124在34.47 MPa压力下，随着打断次数的增加，其重均分子量由278 700降低至236 700，见图1。收获重均分子量278 700、253 500、236 700的多糖样品，分别用4批兔源5型血清与市售血清检测各取样点样品的多糖含量。结果显示，418批次血清检测的多糖含量结果与其余3批次血清的检测结果趋势虽存在差异，但偏差＜15%，符合药典相关规定，属正常波动，认为各批血清检测的多糖含量变化趋势一致，无明显差异，见图1。结果表明，不同批次自制兔源5型血清与市售血清在检测不同相对分子质量的5型多糖方面具有可比性。
用4批兔源5型血清与市售5型血清分别检测厂家1、厂家2、厂家3疫苗中的5型多糖含量，检测结果见表3。检测结果间CV值均＜5%，表明自制的4批兔源5型血清在检测不同来源多糖时与市售血清一致，无明显差异。
2.4
室间、室内精密度
对4批自制兔源5型血清进行室内、室间精密度考察，相应的多糖含量CV值均＜10%，见表4、表5。表明4批自制兔源5型血清检测精密度高。
2.5
稳定性考察
工作浓度的4批自制兔源5型血清在2~8 ℃放置56 d后，标准曲线各梯度响应值与0 d响应值之间的CV值均＜10%，且均能保持良好的线性相关性，结果见表6。表明4批自制兔源5型血清在工作浓度下于2~8 ℃至少能够使用56 d。
3
讨论
肺炎链球菌（或称肺炎球菌）是具有荚膜的革兰阳性球菌，荚膜是其重要毒力因子，其主要成分是荚膜多糖。根据荚膜多糖化学结构不同，目前肺炎球菌已分离鉴别出46个血清群、98个血清型。自2005年成都公司研制出首个国产23价肺炎球菌多糖疫苗以来，我国已有多家公司上市23价肺炎球菌多糖疫苗，均由 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F等23种血清型的荚膜多糖混合配制而成，覆盖了全世界已报道的65%~91%血清型分离菌株，每一血清型荚膜多糖的含量为25 μg/剂，主要用于预防老年人尤其是老年住院患者的肺炎感染。
检测多糖含量是23价肺炎球菌多糖疫苗效力评价的有效手段，也是保证疫苗质量稳定有效的重要指标。1983年，Robbins等建立了光散射定量比浊法检测各型多糖含量，中国药典2020年版三部也规定23价肺炎球菌多糖疫苗中的多糖含量由速率比浊法进行检测，检测所用标准血清均为目前通用的市售血清，价格高昂。为降低在疫苗生产过程控制中多糖含量检测的费用，成都公司自行制备了5型肺炎球菌特异性血清。
本研究自制的4批兔源5型血清在工作浓度（稀释倍数）8~75倍之间，与线性考察梯度浓度（0.625、1.250、2.000、2.500、4.000 μg/ml）反应的响应值呈现出良好的线性相关性，线性r均＞0.985。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等也是影响免疫血清效价的重要因素。不同批次血清之间的工作浓度存在较大差异，造成此种情况的原因可能有家兔个体差异、抗原制备差异等，具体原因及之间的关系尚有待进一步深入研究。
本研究自制的4批兔源5型血清与其余22个型别多糖无交叉反应，特异性良好。自制5型血清与市售血清在检测不同相对分子质量5型多糖方面具有可比性，同时自制5型血清批次之间对于检测不同相对分子质量5型多糖无明显差异，在检测不同来源多糖时也与市售血清无明显差异。
在23价肺炎球菌多糖疫苗的生产过程中，对单型精制多糖以及疫苗成品都有相关的稳定性要求，其主要指标就是多糖含量。本研究通过不同相对分子质量多糖检测以及不同来源多糖含量检测的可比性考察，明确了自制血清与市售血清在稳定性检测以及检测不同来源多糖适用性方面存在一致性，可以替代市售5型血清。这种可比性考察是必要的，也是血清制备中质量控制的一项重要指标。
本研究对4批自制兔源5型血清进行室间、室内精密度考察，相应的多糖含量CV值均＜10%，表明自制兔源5型血清检测可靠性良好。工作浓度的4批自制兔源5型血清在2~8 ℃放置56 d后，标准曲线各梯度（0.625、1.250、2.000、2.500 μg/ml）响应值与0 d响应值之间的CV值均＜10%，决定系数均＞0.99，表明自制兔源5型血清在工作浓度下于2~8 ℃至少能够使用56 d。
成都公司制备的4批兔源5型肺炎球菌特异性血清具备较好的特异性和稳定性，与市售血清有较好的可比性，可以用于速率比浊法检测5型肺炎球菌多糖疫苗（含单型多糖及成品）的多糖含量。
作者
张磊 颜熙熙 肖翠 程亚刚 于荣清
成都生物制品研究所有限责任公司细菌性疫苗二室， 成都 610063
通信作者：于荣清，
Email：rongqing861020@163.com
引用本文：张磊 , 颜熙熙, 肖翠, 等. 兔源5型肺炎球菌特异性血清参考品的质量控制检测 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 343-348.
DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240529-00036
