导读：流感病毒感染宿主包括人类和动物，可造成轻度至重度和致命性疾病。尽管目前有多款流感疫苗获批上市，但由于流感病毒广泛的抗原变异，容易导致减弱的保护效力。且当前流感疫苗多借助活病毒培养，对生产环境要求极高。鉴于mRNA-LNP疫苗在生产周期和免疫应答等方面的独特优势，药企早期就布局了流感mRNA疫苗的开发。
PF-07252220是辉瑞开发的一款基于修饰mRNA的季节性流感疫苗，以针对甲型H1N1和乙型/Yamagata流感为基础，提供单价、二价和四价制剂形式。本期文章，菌菌将详细解析辉瑞关于PF-07252220的专利。
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辉瑞mRNA流感疫苗PF-07252220简介
PF-07252220是辉瑞开发的一款mRNA流感疫苗，编码甲型或乙型流感病毒来源的血凝素（HA）抗原，以单价、二价或四价形式被开发。PF-07252220在早期临床试验中显示出良好的安全性、耐受性和免疫原性。然而其III期临床数据显示出了不同年龄队列的差异，PF-07252220在18-64岁的参与者中体现了免疫疗效，达到了非劣效性和优效性的主要终点。但在65岁及以上的成年人中未达到主要终点（与上市疫苗相比的非劣效性指标）。
图示
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辉瑞mRNA流感疫苗PF-07252220序列设计
2.1 mRNA编码序列
PF-07252220编码序列的选择是基于2021-2022年北半球流感季节的推荐，是以下四种流感毒株来源的HA糖蛋白的全长密码子优化序列：
nWisconsin modRNA (Wisc2019 HA)
nPhuket modRNA (Phuk2013 HA)
nWashington modRNA (Wash2019 HA)
nCambodia modRNA (Camb2020 HA)
基于上述mRNA，PF-07252220具有5种使用形式，包括4种单价mRNA疫苗、以及由4种mRNA组合使用的二价或四价疫苗。
图示
mRNA疫苗抗原推荐（2021-2022年北半球）
2.2 mRNA非编码序列
非编码区序列UTR序列和poly(A)尾在mRNA稳定性和翻译过程发挥重要作用，也是mRNA序列设计的重点。
目前已衍生出3种常用的UTR设计策略：第一种是直接选取高表达的人类基因UTR，例如人alpha珠蛋白mRNA的UTR。使用GCCACCAUG替换了ACCAUG；第二种是通过指数富集（SELEX）的方式来实现UTR的系统演化，已成功在Moderna新冠疫苗中得以验证；第三种是选择病毒来源的UTR，这一策略常用于自复制mRNA的设计。
可供参考的poly(A)尾巴的设计原则主要有2种：一种是采用纯腺苷组成的尾巴，长度一般在100-120 nt；另一种是BioNTech/辉瑞创新发现的分段式poly(A)，在纯腺苷中间插入连接序列，能够在提高mRNA稳定性的同时保持其翻译效率。
辉瑞在专利中公开了mRNA流感疫苗的非编码区序列，其序列特征如下：
nmRNA流感疫苗的5’ UTR长度为54-nt，来源于人α -珠蛋白，并在此基础上对其Kozak序列进行了优化，将ACCAUG替换为GCCACCAUG；
nmRNA流感疫苗的3’ UTR长度为295-nt，由两个序列元件组成，分别来自氨基末端增强子分裂蛋白（AES）和线粒体12S核糖体RNA（12S rRNA），以确保RNA的稳定性和高水平的蛋白表达。
n与新冠mRNA疫苗BNT162b2一致，辉瑞在流感疫苗的设计中也采用了分段式的poly(A)尾巴，总体长度为110 nt的poly(A)由30个腺苷、10个非纯A连接子（GCATATGACT）、以及下游的70个腺苷组成。
图示
2.3 其他修饰
PF-07252220中包含的mRNA是一种经核苷酸修饰的mRNA，其5’端包含帽类似物，结构为m2-7,3’-OGppp (m1-2’-O)ApG，即Cap1。
03
辉瑞mRNA流感疫苗PF-07252220递送系统
编码不同毒株来源的HA抗原蛋白的一种或多种mRNA被包封在一个脂质纳米颗粒（LNP）中。专利公开的LNP组分为可电离阳离子脂质ALC-0315、磷脂DSPC、胆固醇和PEG脂质ALC-0159。其LNP制剂溶解于含300 mM蔗糖的10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中。
ALC-0315与ALC-0159是首次用于辉瑞新冠mRNA疫苗的新型脂质，专利归Acuitas所有，辉瑞/BioNTech通过与Acuitas合作获得了使用许可。
图示
阳离子脂质体ALC-0315的结构式图示 PEG脂质ALC-0159的结构式
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结语
从专利公开信息来看，辉瑞的流感疫苗管线PF-07252220在序列设计和递送系统两方面与新冠疫苗BNT162b2一致。5’ UTR序列，二者均基于人α -珠蛋白mRNA来源的UTR进行了Kozak序列的优化；3’ UTR序列均选择了AES和12S rRNA的串联形式；poly(A)尾同样是长度为110 nt的分段式尾巴30A + 10(GCAUAUGACU) + 70A。脂质递送系统方面，辉瑞的流感疫苗和新冠疫苗均选择了基于ALC-0315与ALC-0159两种新型脂质的配方。
辉瑞针对新冠和季节性流感mRNA疫苗的设计，无疑体现了mRNA技术的灵活性和平台性，仅需替换编码区域序列，即可用于表达任意所需的蛋白，实现预防或治疗疾病的目的。
参考文献
[1] Pfizer. Immunogenic composition against influenza. Patent. US10716846B2 / WO2022234417A1.
[2] Pfizer Initiates Phase 3 Study of mRNA-Based Influenza Vaccine. Retrieved September 14, 2022 from https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizer-initiates-phase-3-study-mrna-based-influenza-vaccine.
[3] Carascal MB, Pavon RDN, Rivera WL. Recent Progress in Recombinant Influenza Vaccine Development Toward Heterosubtypic Immune Response [published correction appears in Front Immunol. 2022 Jun 13.
