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叮叮~，针对上期教师节特约直播，小 M 为大家准备了干货满满的 《细胞凋亡实验手册》，内容涵盖了细胞凋亡机制，各种经典的检测方法和相关检测试剂，并有详细的检测 Protocol 助力您的实验。
废话不多说！我们一起来看看 上期凋亡直播的问答汇总吧~
在上次直播中，小 M 带着大家深入解析了三种主要的细胞凋亡相关知识 (详见往期直播：细胞凋亡：机制、标志物与检测方法的解决方案)。
在和各位老师们的深入探讨中，有许多老师提出了许多精彩的问题，小 M 也是精心整理了一份 Q&A 汇总，涵盖了直播中讨论的热点话题和常见疑问，快来随小 M 一起看一下吧~
01
众多细胞检测凋亡的方式，该选哪一个呢？为什么选电镜 (TEM) 的比较少，而选 Western blot 的比较多？
检测细胞凋亡的方法有很多种，选择哪种方法需要考虑实验目的、样品类型、检测灵敏度、特异性、操作难度等因素。
1. 电子显微镜 (TEM) 的优势在于可以观察到细胞凋亡的典型形态学变化,如染色质凝聚、细胞质缩小、细胞膜皱缩等，以及细胞的超微结构，但需要专业设备和技术,操作复杂,样品制备耗时。TEM 通常用于研究凋亡的形态学特征和机制，不适合大规模样品检测。
2. 常见的检测方法是先用 Annexin V/PI 等方法进行初步验证,再用 Western blot 等方法验证关键蛋白的表达，Western blot 操作相对简单,可定量分析。
02
我想检测血小板凋亡，可以用哪种凋亡检测方式？
血小板的凋亡标志物包括线粒体内膜膜电位 (Δφm) 的去极化、细胞色素 c 的释放、促凋亡和抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族的表达含量变化、Caspase-3 的激活、磷脂酰丝氨酸 (PS) 的暴露、血小板收缩、碎裂成微粒、血小板表面的水泡和丝状足挤压等 (PMID: 22383127)。常用的检测方法包括流式细胞术、Western blot 分析和电子显微镜 (TEM)，是检查各种生理和病理环境中血小板凋亡的有用工具。
03
Annexin V/PI 双染的流式细胞术中,四个象限的细胞分别代表什么状态？
左上象限 Q1：Annexin V-/PI+，一般是机械损伤的细胞，如果这个象限的细胞特别多，需要排除实验操作异常。
右上象限 Q2：Annexin V+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞和坏死细胞。
右下象限 Q3：Annexin V+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
左下象限 Q4：Annexin V-/PI-，此区域的细胞为活细胞。
04
凋亡的荧光检测方法中，流式细胞术和荧光显微镜检测哪个结果更准确一些呢？
在凋亡检测中，流式细胞术和荧光显微镜检测各有特点。
流式细胞术：可实现高通量分析，定量分析荧光强度，可实现对不同细胞群体的分析。但样本处理相对复杂，可能导致细胞损失或结果偏差。
荧光显微镜：可以通过荧光显微镜观察细胞形态变化，提供形态学信息，操作简单，适合小规模实验。但通常只能分析有限数量的细胞，结果的统计学意义较低，通常用于定性，难以进行准确的定量分析。
05
JC-1 一直染不出来是什么原因？改如何优化实验？
建议增加阳性对照 CCCP (HY-100941)，对于大多数细胞，经 CCCP 处理后，线粒体膜电位会完全丧失，增加阳性对照可以 JC-1 失效或者实验操作的问题，然后再针对性的优化实验。
06
衰老细胞的线粒体膜通透性也会发生改变，检测膜电位能区分凋亡和衰老吗？
膜电位变化并不是凋亡或衰老的唯一指标，建议结合其他检测方法和生物标志物的分析 (如 Annexin V/PI 染色、Caspase 活性检测、活性氧水平/β-gal 活性检测等)，有助于更准确地评估细胞的生理状态。
07
如果购买 MCE 细胞凋亡化合物库，不用自己寻找目标化合物吗？是否只需要提供靶点通路由 MCE 来帮忙找？如何仅筛选其中的部分化合物呢？
MCE 细胞凋亡化合物库（HY-L003）收录了 2,400+ 种凋亡相关产品，主要靶向凋亡信号通路种主要靶点，可以用于细胞凋亡信号通路及相关疾病的研究。
1. 如果您仅需要其中某些靶点或者信号通路的化合物，MCE 可根据您的需求进行匹配，定制您需要的化合物库。另外，我们也提供一站式药筛服务。
2. 如果您仅想筛选其中的部分化合物，也是可以根据您的需求定制的。比如，有些客户只想做老药，就可以保留 FDA 的，只想做新药，就可以保留还没上临床的；比如有些客户想要其中的代谢物或者天然产物等，因此，MCE 可根据您的需求来定制。
08
有的细胞凋亡抑制剂浓度过高或者处理时间过长会导致细胞死亡，应该怎么避免?
一般来说，细胞凋亡抑制剂可以抑制细胞内发生的凋亡，但浓度过高或者处理时间长可能会对细胞产生非特异性毒性、细胞代谢紊乱、激活其他细胞死亡通路 (如坏死性凋亡、自噬等)，导致细胞死亡等。
建议您多查阅文献，并设置浓度梯度实验和时间梯度，选用文献报道的凋亡特异性抑制剂，以减少对其他细胞生理过程的干扰，并注意观察细胞的形态、增殖和存活情况，确定最佳实验条件。
09
如果我想要通过抑制 P53 去抑制凋亡通路，有什么可用的抑制剂吗？
有文献表明，p53 可通过不同的途径诱导细胞周期停滞和凋亡 (PMID: 29149101)，抑制 p53 的研究主要集中在小分子抑制剂（如 PFT-α）和 RNA 干扰技术。
PFT-α (HY-15484) 是一种小分子抑制剂，能够特异性抑制 p53 的活性。它通过与 p53 结合，阻止其转录激活功能，从而减少 p53 依赖的凋亡。在多种细胞模型中，PFT-α 被证明可以降低因化疗药物引起的细胞死亡。
此外，使用小干扰 RNA (siRNA) 或反义寡核苷酸 (ASO) 来特异性降低 p53 的表达，从而抑制其介导的凋亡。
10
Caspase 的抑制剂是通用的吗？在选择凋亡抑制剂时该如何选择？
Caspase 抑制剂是广泛应用的细胞凋亡抑制剂，例如如 Ac-DEVD-cho, z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk, 分别靶向 Caspase 3、泛-Caspase、Caspase 8、Caspase 9。然而，某些细胞和组织并不表达某种或者多种 Caspase，因此，首先要确定你的样本中 (细胞或者组织) 是否有表达这个 Caspase 蛋白，然后参考文献中的处理浓度和时间，看文献中有没有相同或者类似的模型，最终确定选择哪个抑制剂比较合适。
11
细胞凋亡和细胞坏死能够同时存在吗？
细胞凋亡和细胞坏死能够同时存在。
细胞死亡是一个复杂的生物学现象，细胞凋亡和细胞坏死是两种不同的细胞死亡方式，细胞在不同的刺激下可能会经历不同的死亡途径。但细胞凋亡和细胞坏死也有共同存在的机制。
1. 在某些情况下，细胞可能同时经历凋亡和坏死。例如，在严重的氧化应激或细胞损伤下，细胞可能首先激活凋亡通路，但由于损伤过于严重或时间过长，最终转变为坏死 (PMID: 11035261)。
2. 细胞凋亡和坏死的信号通路之间存在交叉。例如，在炎症性疾病中，某些炎症因子或细胞因子可以同时激活凋亡和坏死的相关信号通路 (PMID: 11997180)。
3. 在某些疾病 (如肿瘤、神经退行性疾病等) 中，细胞凋亡和坏死也有可能同时发生，影响疾病的进展和治疗效果。
12
确定凋亡的发生后是否有必要确定是内源或者外源的？
在某些情况下是必要的，确定是内源性还是外源性的有助于研究细胞发生凋亡的具体机制，有助于药物发现的研究。
例如，确定抗癌药物诱导癌细胞凋亡的具体途径可以明确抗癌机制，对临床上的用药具有一定的指导意义 (PMID: 33879127)。此外，凋亡的失调会导致疾病的发生，确定凋亡的具体机制有助于研究疾病的发病机制，助力药物开发。比如，Fas 信号通路缺陷的 Lpr 和 gld 小鼠会出现淋巴结肿大和脾肿大，并发展出一种类似于人类系统性红斑狼疮 (SLE) 的疾病，表明外源性凋亡通路在自身免疫病研究中发挥着重要作用 (PMID: 22683550)。
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Bcl-2 抑制剂，引发内源性凋亡。 |
Caspase 3 抑制剂，凋亡抑制剂。 |
泛-Caspase 抑制剂，凋亡抑制剂。 |
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