【神经科学前沿技术培训系列】详见文末
责编︱王思珍
JARVIS
本文通过使用优化后的DISCO方法成功实现了对小鼠骨骼和牙齿组织的三维神经分布成像，并提高了成像深度和透明度。先进的成像技术揭示了神经在骨骼和牙科组织中的分布和形态特征，提供了对神经在这些组织中的功能的更深入理解。这些新技术为研究硬组织中神经的生物学功能、疾病状态下的变化及其与其他细胞类型的相互作用提供了新的视角。
股骨髓腔内PGP9.5免疫标记的神经纤维
这项研究使用改进的DISCO组织透明化方法实现小鼠股骨和牙齿组织的透明。首先介绍了用于神经纤维三维可视化的组织透明化步骤，并对三维成像后的股骨和牙齿进行表面3D渲染，使用Imaris“Surface”模块从脱钙骨中分割骨髓和牙髓。这是重要的一步，因为矿化骨和周围肌肉、韧带的自身荧光通常会掩盖骨深处的标记。解剖边界使用多个相隔20-30 μm的横截面图手动定义，以创建骨髓或牙髓组织的3D表面渲染，从而提取骨内PGP9.5神经纤维信号，PGP9.5是一种广泛标记神经轴突和神经末梢的标记物，用于研究神经系统的分布和形态（图1）。
使用PGP9.5作为全神经标记物，对小鼠的股骨进行标记和成像。作者通过改进的DISCO透明化方案，观察神经纤维如何通过股骨的营养孔进入骨髓腔，追踪其分支和终末。实验中还通过视频记录和显微镜技术，详细描绘了神经的分布情况和终末形态。
神经分布
PGP9.5标记的神经束通过股骨的营养孔进入骨髓腔，分别位于股骨的近端和远端。近端的神经在股骨的转子部位和股骨颈部有广泛的分支，并向下延伸到干骺端，但未穿过生长板。远端的神经终止于软骨下骨的骨髓腔内。
神经终末形态
神经纤维经常沿血管走向骨髓腔内，并以经典的螺旋形态终止在血管周围，或作为自由末梢远离血管。自由末梢中有些具有沿轴突长度分布的腺体状膨大，有些则没有，通常以单一的球状末梢结束。
密度与分布
神经的密度在股骨的下部较低，尤其在干骺端的下三分之一和远端的骨髓腔内最少。神经束向下延伸时，经常有分支向骨内膜侧投射，终止于皮质骨附近。一些轴突与皮质骨中的沃尔克曼管和哈弗斯管相连，沿途到达或离开骨膜。复杂末梢：在股骨的中下部位，观察到一些非常复杂的末梢，这些末梢通常是一个分支轴突的终点，具有多个分支点和终末。例如PGP9.5标记的复杂末梢总长度约为3729 μm，有43个分支点和25个终末（图2）。
图2 全组织免疫标记和三维(3D)荧光成像
显示PGP9.5标记的小鼠股骨神经纤维及其末梢
股骨髓腔内CGRP免疫标记的神经纤维
CGRP（降钙素基因相关肽）是一个标记肽神经元的分子，特别是在感官神经中。研究表明，CGRP标记的神经轴突可以进入骨髓腔，沿着骨的营养孔和血管分布，但与其他神经标记物如PGP9.5不同，CGRP标记的神经轴突有其独特的分布和终末形态。研究旨在明确CGRP标记的感官神经轴突如何通过股骨的营养孔进入骨髓腔，并研究这些神经纤维在股骨内的分布模式和终末形态。特别关注这些神经是否沿血管分布，如何终止在骨髓腔或骨内膜附近。CGRP标记的神经轴突通过股骨的营养孔进入骨髓腔，这些孔位于股骨的近端颈部或远端骨骺。这些神经轴突沿股骨干方向下延伸，通常沿血管分布，但没有像PGP9.5标记的轴突那样的螺旋形态。
神经轴突的特征
神经纤维沿其长度有大量的“过路”膨大（en passant varicosities）。大多数神经终末在骨髓腔内或靠近内膜处以自由末梢的形式终止，远离血管。神经纤维的走向：一些轴突沿血管从骨髓腔延伸进入沃尔克曼管和哈弗斯管，这些管道位于皮质骨内。另一些轴突从皮质骨进入骨髓腔并在骨髓腔内终止。
复杂的神经终末
CGRP标记的神经纤维在股骨的下部骨髓腔内偶尔以非常复杂的终末形态存在。一个复杂终末的实例显示其总长度约为7659 μm，具有102个分支点和65个终末点（图3）。
股骨髓腔内TH免疫标记的神经纤维
酪氨酸羟化酶（TH）是合成儿茶酚胺的速率限制酶，通常作为交感神经去甲肾上腺素神经纤维的标记物。TH标记的神经纤维与降钙素基因相关肽（CGRP）标记的感觉神经纤维具有不同的分布和形态特征。CGRP标记的神经纤维在股骨中的分布与终末形态已经有了一定的了解，但TH标记的神经纤维的具体分布和形态尚需进一步探究。
神经纤维的分布
TH标记的神经纤维具有独特的螺旋形态，通常围绕血管分布。相较于CGRP标记的神经纤维，TH标记的神经纤维较少分支到骨髓腔或靠近骨内膜处。
神经纤维与血管的关系
TH标记的神经纤维在股骨远端骨端下方的骨下软骨区域有较多的分布。TH标记的神经纤维沿骨皮质的管道穿过，跟随血管从骨髓腔进入骨皮质，或者从骨皮质进入骨髓腔并在那里终止。
复杂的分支形态
在股骨下部的骨干区域，观察到TH标记的神经纤维与血管之间有复杂的分支关系。发现一个单一的轴突可以分支并绕绕过两个或三个独立的血管，末梢紧贴血管（图4）。
下颌牙髓和周围牙周组织的
PGP9.5免疫标记的神经纤维
小鼠下颌骨包括三颗磨牙和一颗持续生长的门牙。了解这些牙齿的神经支配有助于研究牙齿感觉及其相关的生物学机制。使用PGP9.5标记神经纤维，观察其从下牙槽神经发出，沿磨牙和周围组织分布的情况。通过三维图像发现神经纤维从下牙槽神经发出，分成小束，进入磨牙的牙髓。神经纤维穿过牙根到达冠状牙髓，形成密集的神经丛。部分神经纤维通过附加管道进入牙根的主根牙髓或直接到达冠状牙髓。神经纤维在下颌骨和牙周韧带中以不同形式终止，包括自由末梢和更复杂的Ruffini样末梢。观察到一些PGP9.5标记的细胞样结构存在于牙槽骨和牙周韧带中（图5）。
图5 PGP9.5免疫标记的神经纤维
下颌牙髓和周围牙周组织的
CGRP免疫标记的神经纤维
下颌牙髓和周围牙周组织的
TH免疫标记的神经纤维
进一步探讨了小鼠牙髓及其周围组织中的神经支配情况，特别是着重研究了酪氨酸羟化酶（TH）标记的神经纤维的分布和终末结构。牙髓的神经支配对于理解其感觉机制和神经生理学有重要意义。使用TH标记技术对神经纤维进行追踪，以观察其在牙髓及周围组织中的分布。
神经纤维的进入途径
TH标记的神经纤维通过牙根尖孔和附加管道进入牙髓，但通过附加管道进入的神经纤维数量明显少于CGRP标记的神经纤维。
在牙髓中的分布
TH标记的轴突在牙髓中较为稀少，并且有时在进入附加管道的神经中完全没有观察到TH标记的纤维。
在周围组织中的分布
TH标记的神经纤维主要集中在血管周围，沿血管螺旋分布，类似于在股骨中的观察结果。
牙周韧带、牙槽骨及牙龈
这些组织中TH标记的神经纤维分布稀少，少数纤维在远离血管的地方终止为自由末梢。
“篮状”结构
TH标记的轴突并未形成类似于PGP9.5标记的神经末梢的“篮状”结构，这些结构主要由CGRP标记的神经纤维构成（图7）。
在这项研究中，作者改进了DISCO组织透明化方案，以标记成年小鼠完整的骨和牙组织中的周围神经纤维及其末梢。支配长骨和牙齿组织的神经纤维有多个分支和终末，并且经常延伸很长一段距离，这使得在传统的组织学切片中很难追踪它们。本文实现了硬组织神经的3D可视化，并且很容易适用于小鼠长骨和牙齿组织的研究。
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