PNAS︱美国国立卫生研究院陈宇团队合作发表针对携带GBA1突变的帕金森症候选药物研发进展

学术   2024-10-22 00:01   上海  

【神经科学前沿技术培训系列】详见文末


撰文陈  宇

责编︱王思珍


戈谢病(Gaucher disease, GD)是最常见的溶酶体贮积病之一,属常染色体隐性遗传病。该病由于位于染色体1q21上编码葡萄糖脑苷脂酶的GBA1基因突变导致机体葡萄糖脑苷脂酶glucocerebrosidase,又称酸性β葡萄糖苷酶,acid β-glucosidaseGCase活性缺乏,造成其底物葡萄糖脑苷脂(glucocerebroside)在肝、脾、骨骼及肺、甚至脑的巨噬细胞溶酶体中贮积,形成典型的贮积细胞即戈谢细胞,导致受累组织器官出现病变。其临床表现为多脏器受累,呈进行性,并可危及生命。目前,酶替代治疗enzyme replacement therapyERT)由于多年临床应用经验以及明确的安全性和有效性已经成为GD的优选标准治疗方案。ERT将重组表达的GCase引入GD患者,特异性地补充患者体内缺乏的酶,从而减少葡萄糖脑苷脂在体内的贮积,实现对戈谢病的特异性治疗。虽然ERT可以有效地治疗Gaucher disease的外周的症状,但是因为重组表达的GCase不能够跨过血脑屏障,所以ERTGaucher disease的中枢神经系统的症状没有帮助。


Sidransky团队在2009年报道了GBA1基因突变不仅是Gaucher disease的致病因素,而且是帕金森症最常见的遗传风险因素:GBA1基因突变携带者(heterozygous carrier)的帕金森症风险是非携带者的五倍。因此,GBA1是一个重要的药物靶标。恢复GCase的功能不仅可以治疗GD,而且有可能延缓帕金森症的发展。该团队长期致力于GD分子伴侣疗法的研发工作。药物分子伴侣是一种能与错误折叠的蛋白结合,并帮助其正确复性或成熟的小分子化合物,具有组织分布均匀和可穿透血脑屏障等特点。目前拟用于GD治疗的常见分子伴侣有氨溴索和NCGC607等。由于GCase药物分子伴侣氨溴索可以穿透血脑屏障,它目前已经在英国率先进入针对帕金森症的临床试验。


近日美国国立卫生研究院Ellen Sidransky/Mark Henderson/陈宇团队在PNAS上发表了题为High-throughput screening for small.molecule stabilizersof misfolded glucocerebrosidase in Gaucher diseaseand Parkinson's disease的文章,针对携带GBA1突变的帕金森症候选药物研发的最新进展。该研究通过GBA1基因突变细胞系的构建,高通量化学发光分析方案的优化,活细胞中溶酶体内GCase活性的荧光测量,以及免疫荧光检测GCase在溶酶体的定位,对10779种小分子化合物进行了测试,从而发现了两类增强溶酶体内GCase活性的小分子化合物:以NCGC326为代表的分子伴侣(pharmacological chaperonesPC)直接结合GCase突变蛋白,帮助其正确折叠,从而增强溶酶体内GCase的活性;以Pladienolide BTrans-ISRIB为代表的蛋白稳态调节剂(proteostasis regulatorsPR)通过改善ER内各种内源性的负责蛋白折叠的分子伴侣的表达,从而增强GCase突变体的正确折叠。PCPR同时使用时呈现出协同作用,有效地增加GCase蛋白水平,并减少GBA1基因突变细胞系中的GCase底物glucosylsphingosine的水平。该研究发现的PCPR为改善GCase活性提供了新的方案。其中PCs已经获得进一步资助,将率先进入下一阶段的优化。
 

该研究首先通过外源基因稳定整合的方法构建了GBA1基因突变细胞系:通过DDPCR对外源基因的定量,外源GBA1的表达水平得到了精准控制。同时,外源GCase采用了HiBiT标记, 实现了对GCase蛋白水平的高通量化学发光定量 (图1

 
1. GBA1基因突变细胞系的构建


使用GCase蛋白水平的高通量化学发光定量方法,该研究通过对10776个小分子化合物进行筛选,发现了140个具有活性的候选小分子化合物(图2。使用GBA1-LysoFQ荧光定量活细胞中溶酶体内GCase的活性,以及免疫荧光检测GCase在溶酶体的定位(图3两种方法作为第二级筛选手段, PC NCGC326PR Pladienolide BTrans-ISRIB被证实可以有效地增强GCase突变蛋白的有效折叠,增加溶酶体内GCase的活性。同时, PCPR同时使用时呈现显著的协调作用:NCGC326Trans-ISRIB同时使用时显著提高GCase的蛋白水平,使GBA1基因突变细胞系中的glucosylsphingosine降低到正常水平(图4

 
2. 小分子化合物的高通量筛选

 
3. 免疫荧光检测GCase在溶酶体的定位

 
4. PCsPR的协同作用


文章结论与讨论,启发与展望

综上,该研究通过构建GBA1基因突变细胞系和多个高通量技术的开发实现了对小分子化合物的筛选,并且鉴定了PCPR两类化合物可以有效提高GCase水平和活性,为治疗GDPD提供了候选药物。由于所筛选的小分子化合物库的样本有限,该研究鉴定的候选药物还有性质尚需改善。该团队已近开展相关工作,希望能够有候选药物能够在下一步进入临床试验。


原文链接:https://doi.org/10.1073/pnas.2406009121


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编辑︱王思珍
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