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责编︱王思珍
帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）是一种常见的神经退行性疾病，临床症状表现为运动障碍、自主神经功能障碍和认知缺陷。其病理学特征之一是大脑内黑质区的多巴胺能神经元出现选择性丢失。PD是一种多因素诱发性疾病，由于遗传、衰老和环境之间复杂的相互作用，导致产生神经退行性病变。虽尚未完全阐明其病理机制，但大量的研究证明，氧化应激诱发的神经元损伤是产生PD的主要因素。在过世的PD患者脑组织的黑质中，脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）和蛋白质羰基含量增加，而在细胞防御机制中发挥对抗过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）作用的谷胱甘肽的前体——还原型谷胱甘肽的含量减少。产生的过量ROS以及累积的脂质过氧化物，造成蛋白质损伤和功能障碍、细胞器衰竭，导致最终细胞死亡。然而，这些导致PD中氧化损伤的ROS的主要来源还未被发掘。2024年10月2日，美国匹兹堡大学的J. Timothy Greenamyre团队在Science Translational Medicine上发表了题为“LRRK2 regulates production of reactive oxygen species in cell and animal models of Parkinson’s disease”的文章。富亮氨酸重复激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）基因突变会增加PD的致病风险。据相关研究报道，抗氧剂能够缓解LRRK2突变体的毒性，暗示其与氧化应激有关。作者使用CRISPR-Cas9基因编辑的HEK293细胞、小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞、大鼠原代腹侧中脑培养物及PD患者来源的淋巴母样细胞细胞系作为模型，发现LRRK2激酶活性升高与ROS产生和脂质过氧化水平上升呈正相关，并且这种相关性能被LRRK2激酶或NADPH氧化酶2（NOX2）的抑制剂阻断。并从机制方面深入证明了LRRK2激酶活性可以调节NOX2亚基p47phox的Serine-345的磷酸化，导致p47phox从胞质中易位至NOX2亚基gp91phox膜上，激活NOX2酶复合物，进而产生ROS。因此，LRRK2激酶活性可能通过调节NOX2活性驱动PD模型中细胞ROS的产生。这对明确导致PD中氧化损伤的ROS的来源有重要意义。1.内源性 LRRK2 激酶活性调节 ROS 的产生
LRRK2 病原突变形式的过表达与 ROS 水平上升有关。为了确定内源性 LRRK2 是否对 ROS 产生有影响，作者首先使用二氢乙锭 （dihydroethidium，DHE） 评估了多种基因操作的HEK293细胞中超氧化物的水平。通过比较表达野生型LRRK2 （LRRK2WT/WT）细胞、 CRISPR-Cas9 基因编辑的LRRK2激酶激活突变体 G2019S （LRRK2GS/GS） 细胞和 LRRK2 无效 （LRRK2−/−） 细胞，作者发现LRRK2GS/GS细胞中DHE的信号显著高于LRRK2WT/WT细胞。再加入选择性LRRK2激酶抑制剂PF360后，阻断了LRRK2GS/GS细胞中上升的DHE信号，表明这些细胞中的ROS的产生取决于LRRK2激酶活性（图1 A、B）。鱼藤酮是一种线粒体复合体I抑制剂，常用于PD模型的造模。鱼藤酮与复合物I的结合会使得电子从电子转移链上游泄漏，与分子氧反应形成 ROS。ROS进而导致蛋白质的氧化损伤及膜脂质过氧化。在LRRK2WT/WT、LRRK2GS/GS细胞中加入鱼藤酮引起了DHE信号的显著增加，然而与PF360共处理时，这个反应被阻止。并且，鱼藤酮不会引起LRRK2无效的细胞中ROS水平上升（图1 A、B）。包括小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞、大鼠中脑多巴胺能神经元、PD患者来源的淋巴母细胞的多种模式细胞的DHE染色结果共同展现出与HEK293细胞中一致的实验结论（图1 A-G）。并且，鱼藤酮处理仅在大鼠中脑的多巴胺能神经元中导致 DHE积累，而不在非多巴胺能神经元中积累，加入PF360处理阻断了DHE累积。在PD患者淋巴母细胞中，使用PF360和MLi2这两种不同的LRRK2激酶抑制剂都能将增加的DHE信号降低至健康对照值（图1 F、G）。为了进一步证明需要LRRK2激酶活性参与介导鱼藤酮诱导ROS的产生，作者在LRRK2无效的HEK293细胞中瞬转LRRK2。结果显示，鱼藤酮导致的DHE信号上升仅在有LRRK2蛋白的细胞中出现（图2 A、B）。此外，用 PF360 处理转染细胞阻断了与表达LRRK2 相关的“挽救”鱼藤酮诱导的ROS的反应（图2 C）。因此，多种遗传学和药理学方法共同表明，鱼藤酮诱导的与PD相关的ROS的产生都需要LRRK2激酶活性。图 2. 表达LRRK2恢复鱼藤酮诱导的LRRK2-/-细胞中ROS的产生持续的ROS的产生和氧化损伤会导致脂质过氧化产物4-HNE的积累。为了评估4-HNE水平，作者在细胞和组织切片中使用了免疫荧光对4-HNE染色。在HEK293细胞中，LRRK2GS/GS细胞中4-HNE荧光信号显著高于LRRK2WT/WT细胞，加入PF360后阻止了这种现象。鱼藤酮处理导致LRRK2WT/WT、LRRK2GS/GS细胞和RAW264.7细胞中4-HNE增加，PF360阻止了这种现象；然而鱼藤酮不能增加LRRK2−/−细胞中4-HNE的含量，这与ROS产量增加的结果一致（图3 A和B）。同时，大鼠中脑多巴胺能神经元和PD患者淋巴母细胞样细胞中，4-HNE免疫荧光信号与DHE结果一致。鱼藤酮处理后，仅在大鼠中脑多巴胺能神经元中导致4-HNE 积累，而不在非多巴胺能神经元中积累，加入PF360阻断了4-HNE累积（图3 D和E）。与健康对照相比，来自PD患者的细胞的4-HNE 升高（图 3 F 和 G)。PF360或MLi2对LRRK2的抑制有效地将源自PD患者淋巴母细胞样细胞中升高的4-HNE信号降低到健康对照值（图 3 F 和 G）。这些结果共同表明，内源性突变和异常的LRRK2激酶活性在HEK293细胞、RAW264.7巨噬细胞、大鼠黑质多巴胺能神经元和PD患者来源的淋巴母细胞样细胞系中调节体外ROS的产生和脂质过氧化。2.抑制LRRK2可防止PD大鼠模型中的脂质过氧化和神经变性
接下来，为了评估这些发现的体内相关性，作者使用了PD大鼠模型。大鼠喂食鱼藤酮，使用LRRK2 激酶抑制剂PF360（5 mg/kg BID）治疗7至10 天，直到它们达到行为学检测终点后，进行分析。为了评估鱼藤酮诱导的氧化损伤，作者评估了脂质过氧化物产物4-HNE的积累。与对照大鼠的黑质多巴胺能神经元相比，鱼藤酮治疗增加了黑质多巴胺能神经元的4-HNE（图4 A 和 B）。组织病理学分析显示，单独使用鱼藤酮会导致TH和Nissl阳性的黑质多巴胺能神经元显著丢失，使用PF360治疗阻止了这种多巴胺能神经元的丢失（图 4 C 和 D）。这些结果与体外结果一致，表明氧化损伤（脂质过氧化）可能受LRRK2激酶活性调节。图 4. LRRK2 激酶抑制可防止PD大鼠模型中的脂质过氧化和神经元变性3. LRRK2 激酶活性调节NOX2产生ROS
为了研究LRRK2活性如何导致ROS的产生，作者首先使用线粒体超氧化物指示剂 mtSOX-deep red检查线粒体ROS的产生。结果显示，相较于LRRK2WT/WT细胞，LRRK2GS/GS 细胞中mtSOX信号显著升高，使用PF360处理后，mtSOX信号被削弱（图5 A和B）。除线粒体外，NOX2是细胞ROS产生的主要来源。作者团队在之前的研究中曾报道过，来自 PD患者的黑质多巴胺能神经元和小胶质细胞中的NOX2活性增强。使用经过验证的PL测定法（PL p47phox–NOX2）检测NOX2活性，相较于LRRK2WT/WT细胞，LRRK2GS/GS 细胞中NOX2活性增加。加入NOX2复合物组装抑制剂NOX2ds-tat阻滞了PL p47phox–NOX2信号，证实了LRRK2GS/GS 细胞中PL信号的特异性。线粒体ROS的上升会激活NOX2复合物，这个过程称为ROS诱导的ROS产生。出乎意料的是，线粒体靶向抗氧化剂mitoTEMPO没有减弱LRRK2GS/GS细胞中NOX2的PL信号，而PF360完全抑制了NOX2的PL信号（图5 C和D）。这些结果表明 LRRK2 激酶活性可能调节NOX2激活。图 5. LRRK2激酶活性促进线粒体ROS产生和NOX2激活为了确定在LRRK2激酶活性存在的情况下，是线粒体还是NOX2是ROS的主要来源，作者使用药理学手段干预HEK293细胞中的DHE信号。用NOX2ds-tat（NOX2复合物组装抑制剂）、mitoTEMPO（线粒体靶向抗氧化剂）、Scrm-NOX2ds-tat（NOX2ds-tat的干扰版本） 或N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC，巯基抗氧化剂）处理HEK293细胞。虽然加入Scrm-NOX2ds-tat和mitoTEMPO都对LRRK2GS/GS 细胞的DHE信号没有影响，但是加入NOX2ds-tat降低了LRRK2GS/GS 细胞的DHE信号（图6 A-D）。加入N-乙酰半胱氨酸也抑制了LRRK2GS/GS 细胞的DHE信号，可能是通过淬灭NOX2产生的ROS造成的（图6 A-D）。接下来，作者探索NOX2是否也是RAW264.7细胞中的主要ROS来源。鱼藤酮处理后，细胞中DHE信号上升，加入NOX2ds-tat后阻断了这个现象（图6 E和F）。此外，Scrm-NOX2ds-tat和mitoTEMPO均未阻止鱼藤酮诱导的DHE信号增加（图6 E和F）。图 6. 在激酶活性 LRRK2 存在的情况下，NOX2活性是ROS的主要来源另外，作者还检测了LRRK2是否在鱼藤酮诱导的PD大鼠模型中调节NOX2活性。鱼藤酮处理导致大鼠黑质多巴胺能神经元中PL信号显著上升，表明神经元中NOX2活性增加。PF360给药治疗阻止了这一现象的发生，说明LRRK2激酶活性位于NOX2激活的上游（图7 A和B）。为了证实研究结果的相关性，作者在PD患者淋巴母细胞样细胞系中检测NOX2活性是否以 LRRK2 激酶依赖性方式升高。用NOX2ds-tat或PF360处理淋巴母细胞样细胞系，并通过DHE和PL p47phox-NOX2多重成像测量ROS产生和NOX2活性。与健康的细胞相比，带有G2019S突变的细胞和PD患者淋巴母细胞样细胞系的DHE信号明显上升，并伴有极高的NOX2活性，而NOX2ds-tat 和PF360处理都能够使得其DHE信号和NOX2活性恢复健康值（图7 C-E）。这些结果说明在PD状态下，ROS增加是由于NOX2酶组装和活性升高导致的，并且受到LRRK2激酶活性升高的影响。图 7. LRRK2抑制剂可防止鱼藤酮诱导的PD大鼠模型和患者来源细胞系中的 NOX2 激活4.内源性LRRK2与p47phox相互作用并调节其磷酸化
NOX2的“职能开关”——p47phox，必须以磷酸化依赖性方式从胞质中转移到膜相关的 NOX2 复合物上，以激活 NOX2 活性并刺激ROS的产生。p47phox上对其易位至膜上至关重要的几个磷酸化位点已被鉴定。作者猜想LRRK2激酶活性与p47phox磷酸化之间可能存在联系。他们开发了一种PL测定法，检测细胞中总LRRK2与p47phox之间的相互作用，在鱼藤酮处理的RAW264.7细胞中，PL LRRK2–p47phox信号显著上升，展示了二者间高强度的相互作用（图8 A和B）。为了研究这种相互作用是否是LRRK2激酶依赖性的，用LRRK2激酶抑制剂与鱼藤酮共处理细胞。PF360 阻止了鱼藤酮诱导的 PL LRRK2–p47phox信号升高，表明相互作用取决于LRRK2激酶活性（图8 A和B）。p47phox上serine345残基已被证明是NOX2激活的重要磷酸化位点。接下来，作者评估了LRRK2激酶活性是否参与调节p47phox Serine345位点的磷酸化。作者使用经过验证的特异性抗p47phox Serine345磷酸化蛋白（pSer345）的抗体与识别总p47phox的抗体进行PL检测。在鱼藤酮处理的LRRK2WT/WTRAW264.7细胞中，PL pSer345-p47phox信号显著增加（图8 C和D）。接下来，作者试图确定 LRRK2 是否在调节鱼藤酮诱导的 p47phox Serine345磷酸化中发挥作用。当使用PF360和鱼藤酮共处理细胞时，阻断了鱼藤酮对p47phox Serine345磷酸化的影响（图8 C和D）。在鱼藤酮处理的LRRK2-/- RAW264.7细胞中，无PL pSer345-p47phox信号，证实了PF360的特异性作用以及LRRK2调节p47phox磷酸化的功能。有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）中也存在着 Serine345位点，受到p38和ERK1/2两种激酶的磷酸化调节。因此，作者试图证明p47phoxSerine345的磷酸化是否直接受到p38或ERK1/2激酶的活性调节。作者使用特异性的p38和ERK1/2抑制剂，adezmapimod及SCH772984与鱼藤酮共处理细胞。与PF360完全抑制鱼藤酮诱导的p47phox Serine345的磷酸化结果相反，不论是单独使用还是联合使用adezmapimod或SCH772984，只能在鱼藤酮处理的RAW264.7细胞中部分抑制p47phoxSerine345的磷酸化作用（图8 E和F）。图 8.内源性LRRK2与p47phox相互作用并以激酶依赖性方式调节其磷酸化长期以来，氧化应激一直被认为是PD发病机制的关键因素。然而，ROS的来源和产生尚未得到充分定义。虽然LRRK2 G2019S突变体含量与氧化应激有关，但二者之间是如何产生关联的尚不清楚。作者使用多种体外细胞模型、PD大鼠模型及PD患者来源的淋巴母细胞样细胞系，发现LRRK2激酶活性调节p47phox磷酸化状态，进而控制NOX2活性，产生ROS，导致发生脂质过氧化在内的氧化应激损伤。其研究证明，LRRK2激酶抑制剂能够改善农药鱼藤酮诱导的氧化应激，但无法在缺乏LRRK2的细胞中发挥作用。在鱼藤酮诱导的PD大鼠模型中，服用LRRK2 激酶抑制剂阻止了该模型中黑质区多巴胺能神经元中的脂质过氧化和NOX2的激活。为 LRRK2 或 NOX2 抑制剂成为未来PD治疗靶点提供了更大的可能性。
原文链接：DOI: 10.1126/scitranslmed.adl3438转载须知：“逻辑神经科学”团队原创性内容，著作权归“逻辑神经科学”所有，欢迎个人转发分享，未经授权禁止转载，违者必究。
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