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伤口愈合延迟是糖尿病的主要并发症，与细胞功能受损有关。目前的治疗方法并不令人满意。从病理学上讲，血管化不足以及皮肤修复细胞增殖和迁移减少是伤口愈合延迟或受损的主要原因。来自各种干细胞的小细胞外囊泡 (sEV) 或外泌体因其治疗潜力而备受关注。SEV具有诸多优势，包括在生理条件下稳定性更高、伦理问题更少、免疫反应风险降低、栓塞和致癌风险低。
本期，EFL以发表在杂志《ADVANCED SCIENCE》的“MiR-17-5p-engineered sEVs Encapsulated in GelMA Hydrogel Facilitated Diabetic Wound Healing by Targeting PTEN and p21”研究为例，解析如何制造miR-17-5p 工程化 sEVs (sEVs17-OE) 并将其封装在明胶甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝胶中，用于治疗糖尿病伤口。
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甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶是一种光交联生物水凝胶，具有可定制的形貌、易于控制的机械和降解性能、高透明度、良好的生物相容性、高保湿效果和高效的阻隔性能。同时，明胶具有蛋白水解降解性和合适的细胞粘附位点等独特特性，并且来源良好。此外，将载有VH298的sEVs或自噬体封装到多孔GelMA水凝胶中，可实现分别延长它们的保留时间至15天和8天，从而加速糖尿病伤口愈合过程。因此，GelMA水凝胶是工程化sEVs的理想载体。（1）sEVs17-OE的分离：hucMSCs 被转染 Lv-miR-17-5p 或 Lv-NC。从工程化 hucMSCs 中采用超速离心法分离出 sEVs17-OE 和sEVsNC。
（2）Gel-sEVs 的制备：首先，将浓度为 5%、10% 和 15% 的 GelMA 与 LAP 引发剂 (0.25%，w/v) 混合。接下来，通过 0.22 μm 过滤器对溶液进行过滤除菌，并通过在 405 nm 光下暴露 1 分钟进行交联。每个样品在 −80°C 下储存，然后冷冻干燥过夜。在紫外光聚合下将 sEVs17-OE 装入生物相容性的 GelMA 水凝胶中（图1）。（EFL可提供系列GelMA水凝胶产品，详询文末区域销售）。（1）载 sEV17-OE 的 GelMA 水凝胶的制备和表征
在紫外光聚合下将 sEVs17-OE 装入生物相容性的 GelMA 水凝胶中，激光共聚焦显微镜显示sEVs17-OE（红色）在 GelMA 水凝胶中成功加载并均匀分布。第 3 天从 GelMA 水凝胶中释放的 sEVs17-OE 在形态上保持完整，与游离 sEVs17-OE 没有明显差异，将GelMA 水凝胶单体浓度从 5% 增加到 15% 导致 GelMA 水凝胶的孔隙率从 61.77% 降低至约 24.27%，孔径显著从 117.4 μm 减小到 15.13 μm。此外，将单体浓度增加到 15% 可使拉伸断裂强度提高到 67.95 kPa，并将溶胀率降低到约 165%。15% 的 GelMA 水凝胶在第6天降解了约 72%，15% 组比其他两组以更恒定和持续的方式释放 sEVs，因此，选择单体浓度为 15% 的 GelMA 水凝胶进行后续实验。体外，游离的sEVs17-OE 被受体细胞迅速内化，然后在 72 小时后降解，而sEVs17-OE从 GelMA 水凝胶中释放是连续的，并且 sEVs17-OE的红色荧光信号即使在 72 小时后在 HG-HUVEC和 HG-HDF中也保持稳定。在糖尿病小鼠两侧用sEVs17-OE和载sEVs17-OE的GelMA水凝胶治疗，显示，游离sEVs17-OE在伤口周围迅速扩散，并在注射后第5天几乎完全代谢。相反，从GelMA水凝胶中释放出的sEVs17-OE的荧光在第5天明显检测到，表明sEVs17-OE持续释放。因此，GelMA不仅保持了sEVs17-OE的完整性，而且实现了sEVs17-OE的持续释放（图2）。 图2 载有sEV17-OE的GelMA水凝胶的制备和表征（2）载 sEV17-OE 的 GelMA 水凝胶加速糖尿病伤口愈合在 db/db 小鼠背部两侧制造全皮肤缺损伤口，将 sEVs17-OE 和 GelMA 单体混合物和LAP添加到伤口中，并通过紫外线 (405 nm) 交联 60 秒。在第 0、5、10 和 15 天拍摄了不同治疗方法的全层伤口的代表性宏观图像。发现用 GelMA-sEVs17-OE治疗的伤口几乎闭合且愈合速度最快。HE染色结果可见，表皮的新形成且组织整齐，皮肤附属物再生，上皮化完全。对于定量分析，GelMA-sEVs17-OE组的伤口闭合率最高，表皮最厚，证明了它们在促进上皮化方面的功效（图3）。 图3 载有sEV17-OE的GelMA水凝胶加速了体内糖尿病伤口愈合（3）载 sEV17-OE 的 GelMA 水凝胶加速血管生成和胶原蛋白沉积术后第 5 天和第 10 天对血管内皮细胞的典型标志物 CD31 进行免疫组织化学染色，以检查伤口部位的新生血管，在第 5 天，Gel-sEVs17-OE 治疗的伤口 CD31 表达最高，采用激光散斑对比成像 (LSCI) 系统观察第 10 天用不同组治疗的伤口周围的血液灌注水平，发现用Gel-sEVs17-OE治疗的伤口明显显示出最高的局部MPU比率，表明其具有最显著的促血管生成作用，立体显微镜下结果显示，Gel-sEVs17-OE治疗的伤口具有最高的相对血管面积，说明Gel-sEVs17-OE加速了伤口部位的血管生成，并显著促进了伤口愈合。胶原沉积与伤口修复过程中的 HDF 功能直接相关，Gel-sEVs17-OE组第15天胶原分布和结构更成熟、更厚、排列更整齐，𝛼SMA表达水平最高，表明第15天许多HDF转化为肌成纤维细胞，愈合过程明显加快。此外，检查第 15 天 p21、PTEN 和 PCNA 的表达，以研究皮肤修复细胞的衰老和增殖。Gel-sEVs17-OE 组的 p21 和 PTEN 表达水平低于游离 sEVs17-OE 组，相反，PCNA表达最高，提示皮肤修复细胞增殖行为活跃，因此Gel-sEVs17-OE可通过延缓衰老、促进增殖等方式加速糖尿病创面血管生成和胶原沉积（图4）。 图4 载有sEV17-OE的GelMA水凝胶通过缓解衰老和增强增殖来加速血管生成和胶原沉积该研究制造了 miR-17-5p 工程化 sEVs (sEVs17-OE) 并将其封装在明胶甲基丙烯酰 (GelMA) 水凝胶中，用于治疗糖尿病伤口。Gel-sEVs17-OE 通过促进血管生成和胶原沉积有效加速伤口愈合。细胞机制可能与局部细胞增殖有关。因此，通过在 GelMA 水凝胶中负载 sEVs17-OE，成功制造了一种新型生物活性伤口敷料，为慢性伤口管理提供了一种选择。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10987139/
