在体育运动中，前交叉韧带（ACL）损伤日益普遍，由于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）人工韧带具有优越的机械性能，因此被广泛用于ACL重建。然而，PET的生物惰性对移植骨整合提出了严峻挑战，需要增强PET表面的生物活性。
来自武汉理工大学的戴红莲等团队采用磁控溅射和水凝胶涂层技术，将锶钙磷和镁离子引入PET韧带表面，实现了镁和锶离子的顺序释放。扫描电子显微镜分析确认了改性PET韧带表面材料的均匀性和稳定性。Mg/Sr-PET顺序释放的协同效应有效促进了体外的成骨、血管生成和神经分化。此外，在使用Sprague-Dawley大鼠进行的重建ACL模型中，组织学染色、微型计算机断层扫描和生物力学测试结果表明，Mg/Sr-PET组显著刺激了血管和神经的形成，并显示出显著的促进骨再生效果。总之，镁和锶离子的顺序释放及其协同作用显著增强了移植骨整合，加速了快速愈合，为改善临床ACL重建结果提供了有价值的见解。相关工作以题为“Magnetron Sputtering Dual-Ion Sequential Release Coating on PET Artificial Ligament Promotes Vascular Nerve Regeneration and Graft-Bone Integration”的文章发表在2024年09月17日的期刊《Advanced Functional Materials》。
1.创新型研究内容
本文设计了一种复合PET人工韧带（Mg/Sr-PET），以实现镁和锶离子的顺序释放。内层采用磁控溅射（MS）技术沉积，旨在实现长期稳定且均匀的锶钙磷涂层释放，以促进成骨。相反，外层则涂覆了含有镁离子的透明质酸基水凝胶，以确保早期控制性释放镁离子，促进血管和神经再生。通过体外研究评估了Mg/Sr-PET韧带的成骨、成血管和成神经分化能力。随后，在Sprague-Dawley（SD）大鼠中创建了前交叉韧带重建（ACLR）模型，通过影像学、组织学染色和生物力学测试等分析方法，评估早期血管生成对移植物-骨整合的影响（图1）。通过促进骨隧道和PET人工韧带界面处的血管生成和神经生成，本研究为增强移植物-骨整合提供了见解，并为临床ACLR带来了宝贵的启示。
图1 本研究用复合PET人工韧带的示意图
【特征】
通过各种实验分析，本文确认了两种前体物质——接枝胱胺二盐酸盐的透明质酸钠（HAC）和氧化透明质酸钠（OHA）的成功改性，以及随后水凝胶（命名为OHAC）的制备。首先，观察到HAC在2983和1538 cm−1处的吸收峰强度发生了变化（见图2C），这分别对应于小分子胱胺二盐酸盐（Cys）中CH2和NH2基团的变形振动。这一点进一步通过1H核磁共振波谱（1H NMR，AMX-500，Bruker，德国）检测到的Cys中亚甲基质子峰在2.95和3.33 ppm处的出现得到了证实（见图2A），表明通过接枝小分子Cys成功对透明质酸进行了羧基改性。此外，比较透明质酸（HA）和氧化透明质酸（OHA）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）也显示出显著差异，其中OHA的光谱明显展示了在1735 cm−1处的C═O键伸缩振动（见图2C）。而且，OHA的1H NMR光谱（见图2B）显示了在4.917、5.002和5.116 ppm处的三个不同质子峰，进一步证实了透明质酸的成功改性。这些综合发现表明，HAC和OHA的成功改变导致了OHAC水凝胶的开发。
图2改性HAC和改性OHA的1H NMR谱图
【体外成骨分化】
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验被用于评估前成骨细胞系（MC3T3-E1）细胞的活性和增殖能力（图3A）。在第1天，PET组、Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组之间没有显著差异。然而，在第3天和第5天，与PET组相比，Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组显示出显著更高的增殖率（p < 0.01），这表明改性PET对细胞增殖有积极影响，其中Mg/Sr-PET组的结果最为有利。此外，在第1天和第3天对PET表面的活细胞染色显示，与未改性的PET相比，MC3T3-E1细胞在改性PET表面上的粘附增强，且随时间推移粘附细胞数量增加（图3B）。这些发现与之前的亲水性评估一致，后者强调了表面亲水性的增加与细胞粘附和增殖能力的增强之间的相关性。之后，在第7天和第14天测量碱性磷酸酶（ALP）活性以评估PET样品体外的成骨分化能力。此外，在第14天和第21天进行了茜素红S（ARS）染色和定量分析，以评估晚期成骨分化的差异。ALP染色结果表明，与PET组相比，Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组表现出更好的结果，其中Mg/Sr-PET组显示出最高的ALP活性（图3D），这一点得到了ALP定量数据的支持（图3C）。值得注意的是，Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组的ALP活性显著提高，而Mg/Sr-PET组的活性最高。此外，ARS染色结果（图3F）显示，与PET组相比，Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组的钙沉积区域更大，其中Mg/Sr-PET组的染色效果最为明显。这些发现表明，相对于PET，Sr-PET、Mg-PET和Mg/Sr-PET展现出更强的促进成骨的能力，这一结论由定量ARS结果证实（图3E）。此外，还进行了定量实时PCR（qRT-PCR）分析，以评估包括ALP、I型胶原（COL-I）、相关转录因子2（Runx-2）和骨桥蛋白（OPN）在内的成骨基因的表达（图3G–K）。结果显示，与PET组相比，Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组成骨基因的表达显著增加，其中Mg/Sr-PET组显示出更强的促进成骨基因表达的能力。Mg/Sr-PET对增强MC3T3-E1细胞增殖和分化的协同效应尤为显著。
图3 复合PET对细胞增殖、粘附和成骨分化的影响
【在体外进行血管生成和神经化】
增强早期血管生成可以促进归巢干细胞的成骨分化，并增加与成骨相关的因子表达，从而诱导周围细胞的成骨分化，这对于促进骨愈合至关重要。CCK-8检测和活/死染色（图4A）表明，改性PET显著增强了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖，相比未改性PET组，Mg/Sr-PET组显示出最显著的改善。通过划痕试验评估了各组细胞的迁移能力。虽然Sr-PET促进了划痕愈合，但Mg-PET和Mg/Sr-PET组均表现出更高的迁移率，在24小时内完全闭合划痕。血管生成实验显示，Sr-PET和Mg-PET组中管形成增加，而Mg/Sr-PET组显示出更多的血管组织存在，突显了镁和锶离子在促进HUVECs血管生成方面的显著协同作用。对管长度、节点数和节点数进行的统计分析（图4E–H）证实，Mg/Sr-PET组有效加速了血管生成。血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）对于骨骼发育过程中的生理性血管生成至关重要。经过7天培养后进行的qRT-PCR分析显示，Mg/Sr-PET组显著上调了VEGF和FGF的表达（p < 0.001）（图4J，K）。
图4 复合PET在体外形成血管和促进神经再生的能力
【体内实验】
血管和神经在肌腱-骨连接处的骨生成过程中至关重要。骨骼具有丰富的血管分布和高代谢活性。组织损伤后会发生缺氧，需要形成新的血管来输送氧气和营养物质，同时排除代谢废物。骨内神经通过释放神经递质、神经肽和神经营养因子调节成骨细胞和破骨细胞的行为和功能，从而通过调节骨沉积和骨吸收影响骨代谢平衡和骨稳态。为评估PET、Sr-PET、Mg-PET和Mg/Sr-PET组在体内的血管生成和神经再生能力，在2周和4周时对组织切片进行免疫荧光染色，标记血管生成标志物CD31和神经元标志物β3-Tubulin（见图5），并对荧光强度进行定量分析。在2周时，与PET和Sr-PET组相比，Mg-PET和Mg/Sr-PET组中CD31和β3-Tubulin的表达显著增高，表明新血管生成和神经存在增加，这归因于镁离子的早期释放。相反，在4周时，观察到的新血管和神经较少，这可能是由于骨生成矿化的开始、血管和神经的退化以及组织专注于骨生成而非血管化所致。此外，在4周和12周时，通过苏木精-伊红（HE）和Masson染色展示了移植物-骨界面的组织修复情况（见图6）。为了更直观地反映各组在新骨形成方面的差异，对各组的新骨和胶原沉积区域进行了定量分析。在4周时，PET组的移植物周围有纤维组织和炎症细胞，而Sr-PET组的新骨形成有限。Mg-PET组显示出微血管生长，而Mg/Sr-PET组则展示了新骨组织和微血管形成，且纤维组织较少。在12周时，PET组未展示新骨形成，界面处有较厚的纤维组织，而Mg-PET组显示成熟的动脉组织和红细胞。Mg/Sr-PET组展示了大量的新骨组织，纤维组织减少，并且移植物-骨界面整合改善。有效的血管生成对于组织工程支架的营养供应、组织生长和促进移植后的骨整合至关重要。最近的研究强调了神经再生在骨组织形成中的重要作用。新生血管通过促进干细胞、内皮细胞和血管生成因子的招募和归巢，支持细胞生长和活动，从而促进新骨形成部位的细胞聚集。充足的血液供应对于植入物与宿主骨的整合至关重要。此外，神经纤维分泌的神经肽如降钙素基因相关肽、血管活性肠肽和P物质，可以通过增加cAMP的产生，增强成骨细胞分化并促进骨形成。本文发现表明，Mg/Sr-PET组通过在7天内释放Mg2+促进神经血管化，并通过释放Sr2+支持长期骨生成，协同增强移植物-骨整合。
图5 神经血管免疫荧光染色
图6 PET组、Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组的组织切片的HE染色和Masson染色结果
为了更准确和全面地评估各材料组的骨整合效果，本文采用微CT分析检查了术后12周股骨和胫骨隧道内不同位置的骨隧道面积（见图7A-C）。结果显示，Mg/Sr-PET组在所有位置的股骨和胫骨隧道中均表现出最小的骨隧道面积（见图7A）。对平均骨隧道面积的统计分析进一步证实，Mg/Sr-PET组在所有位置均显示出最小值，与PET、Sr-PET和Mg-PET组相比，差异具有统计学意义（p < 0.05）。此外，Mg/Sr-PET组在股骨和胫骨内每个位置的骨隧道横截面积也最小。此外，通过微CT的3D重建结果（见图8A）显示，术后12周时，Mg/Sr-PET组移植物（黄色表示）周围的新骨形成（蓝色表示）显著增加。对胫骨和股骨隧道内的骨体积/总体积（BV/TV）进行定量分析，结果显示Sr-PET、Mg-PET和Mg/Sr-PET组的值高于PET组，其中Mg/Sr-PET组的值最高。具体来说，在股骨隧道中，Sr-PET、Mg-PET和Mg/Sr-PET组的BV/TV值分别为40.75 ± 7.0%、30 ± 7.3%和65 ± 6.5%，显著高于PET组的12.75 ± 4.5%（p < 0.01）。在胫骨隧道中观察到类似的BV/TV趋势，进一步强调了Mg/Sr-PET组优越的骨整合性能。随后进行了直接反映移植物和骨愈合情况的生物力学测试，即拉出试验。在术后12周，对所有组的移植物样本进行了生物力学评估，并分析了最终失效载荷和刚度（见图8C-E）。Sr-PET、Mg-PET和Mg/Sr-PET组的最大失效载荷（分别为46.0 ± 4.3 N、35.6 ± 1.2 N和76.4 ± 5.1 N）显著高于PET组（28.7 ± 3.7 N），失效刚度也表现出类似趋势。
图7 手术后12周PET组、Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组的Micro-CT分析
图8 手术后12周PET组、Sr-PET组、Mg-PET组和Mg/Sr-PET组的Micro-CT三维重建分析和生物力学测试
2.总结与展望
总之，本文设计了一种经过Mg和Sr离子顺序释放改性的PET人工韧带，以解决PET移植物固有的生物活性不足问题，这常导致长期炎症、移植物周围愈合不良、骨隧道扩大以及ACL重建后移植物-骨整合不理想等问题。认识到血管和神经在成骨过程中的关键作用，本文的改性旨在促进这些过程，以实现更好的移植物-骨整合。体外实验显示，短期释放的Mg2+有效激活了VEGF和NGF的表达，从而促进了血管和神经的再生。此外，长期释放的Sr2+被证明上调了Runx-2和OPN的表达，促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化。同时，本文在SD大鼠中采用了ACLR模型。影像学和组织学分析结果证实，Mg/Sr-PET通过其Mg和Sr离子的顺序释放，显著增强了早期血管生成和神经生成，最终改善了移植物-骨整合。这种利用血管生成和神经生成来增强骨隧道-PET人工韧带界面处移植物-骨整合的创新方法代表了一项突破，为优化临床ACL重建策略提供了新的视角。
文章来源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202410389
