来源|沙利文重组Ⅲ型三螺旋胶原蛋白白皮书
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关于III型胶原蛋白性质全解析与功能大揭秘
胶原蛋白是细胞外基质的重要成分，对维持皮肤组织结构和功能具有重要的支撑作用。人体胶原蛋白共有28型，我们皮肤的胶原蛋白主要由I型和III型胶原蛋白组成。
其中III型胶原蛋白多位于真皮浅层，纤维较细，呈疏网状，围绕在细胞周围，决定了皮肤弹性，缺乏见热度，多存在于婴儿期。成年后，皮肤III型胶原逐年减少，细胞修复能力减弱，引起各种皮肤衰老问题。简单来说，III型胶原蛋白是幼稚新生的胶原，可促进皮肤新生。
一、胶原蛋白的理化性质
不同提取工艺与提取原料对胶原蛋自的理化性质会产生不同影响,如在热稳定性方面，通常来说陆生动物胶原蛋白的热稳定性高于水产动物。天然胶原蛋白在生物体中广泛存在, 在其提取制备过程中,以猪、牛等哺乳动物以及鱼类为主要来源。
胶原蛋白的热稳定性：
不同来源的胶原蛋白在其应用领域中的表现, 很大程度上受其热稳定性影响胶原蛋白的热稳定性主要取决于分子结构中的脯氨酸和羟脯氨酸含量,这些氨基酸能够形成吡咯烷环和氢键,从而增强分子的稳定性。随着分子中脯氨酸和羟脯氨酸含量 的增加,以及交联密度的提升,胶原蛋白的热稳定性也随之提高。
通常,来自陆生哺乳动物的胶原蛋白,例如羊骨、牛皮、猪皮和鼠尾肌腱中的胶原蛋白,其热稳定性普遍优于水产动物来源的胶原蛋白,表现为更高的热变性温度。
胶原蛋白性质与提取工艺的关系：
胶原蛋白的酸、碱、酶提取法均涉及长时间在对应溶液中浸泡,以去除杂质蛋白并提取胶原蛋白,并要通过盐析和长时间透析进行纯化处理胶原蛋白长时间暴露于碱性、酸性及盐等化学试剂中可能会对胶原蛋白的化学性质造成不同程度的影响。
研究表明,提取时间对胶原蛋白的性质有显著影响,如LIN等人的研究显示,随着提取时间延长,鸟爪胶原蛋白的成纤维能力逐渐下降,且长时间提取的胶原蛋白热变性温度低于短时间提取的OZEUGOLIS等人的研究则发现,不同提取方法会影响胶原蛋白的黏度和溶解度,例如醋酸提取的牛跟腱胶原蛋白黏度较高,而胃蛋白酶提取的胶原蛋白在酸性条件下的溶解度显著 提高。此外,YOSHIMURA等人的研究指出,碱溶液处理会破坏胶原蛋白分子端肽的共价键,减少分子间的共价交联,进而降低其热稳定性。这些研究均表明,提取条件和时间对胶原蛋白的最终性质有重要影响。
二、III 型胶原蛋白的功能
（一）III 型胶原蛋白参与维持皮肤和组织的弹性和稳定性
III型胶原蛋白是一种在人体皮肤、筋膜、肌腱等组织中广泛分布的蛋白质,具有重要的生物学功能和应用价值。胶原蛋白构成了皮肤成分的70%, 在人体四肢的活动过程中,皮肤中的胶原蛋白扮演着至关重要的角色。它不仅为皮肤提供了必要的保护, 还赋予了皮肤适中的弹性和硬度,使得手脚能够灵活弯曲,跳跃时也能展现出良好的弹性作为维持皮肤和肌肉弹性的关键成分,胶原蛋白促进了肌肉细胞的连接,赋予了它们弹性和光泽。肌肉的主要成分是肌纤蛋白和肌球蛋白,而胶原蛋白则起到了细胞间粘合的作用。由胶原蛋白分子构成的立体骨架,有助于保持身体的良好姿态,同时确保了适当的柔韧性。
III型胶原蛋白是人体中第二丰富的胶原蛋白类型,它是纤维状胶原组织中的关键结构成分。III型胶原蛋白主要存在于血管、内脏和肌肉等组织中，对于细胞外基质的整合和修复起到关键作用。它在血管中形成了大量的纤维网络,起到支持和强化血管壁的作用,保持血管壁的弹性和稳定性,从而使血管能够承受血液的冲击和压力。此外,在如肝脏、肺部和肾脏等的内脏器官中, III 型胶原蛋白起着支持和保护内脏器官的正常运作的作用。
皮肤老化：
自然老化：随着年龄的增加,人体皮肤I型和III型胶原蛋白的含量会逐渐减少,且IIII型胶原之比呈上升趋势。胎儿出生后,III型胶原的分解量大于合成量,导致了III型胶原不断流失;I型胶原在8岁之前合成量大于分解量,进入青少年阶段则呈相反变化趋势。
光老化：紫外线也是导致皮肤光老化的因素,在临床上的表现通常为经常暴露在阳光下的皮肤区域出现粗糙、增厚,以及伴有深色的皱纹这些皮肤区域还可能存在色素沉着过度,伴随有毛细血管扩张,导致肤色变得暗沉在某些情况下,紫外线照射还可能增加患皮肤癌的风险在光老化的过程中,活性氧、基质金属蛋白酶的活性以及胶原蛋白的分解都有所增加,这些因素共同破坏了细胞外基质的平衡状态,导致体内胶原蛋白总量的减少。一旦胶原蛋白流失,它是不可再生的。因此,如果不及时补充,皮肤就会逐渐出现皱纹、变得松弛、失去弹性等老化迹象。对于皮肤真皮层的细胞来说,胶原蛋白是一种重要的防御紫外线伤害的物质。
血管、组织脆弱破裂
埃尔勒•当洛斯综合症(EDS):COL3A1基因的突变会引发埃勒斯- 当洛综合症 (Ehlers-Danlos syndrome, EDS),是一种罕见的、可能危及生命的遗传性疾病。在EDS患者中,由于COL3A1基因的突变,导致 III 型胶原蛋白合成受损,进一步导致血管、子宫、肠道等空腔器官的完整性和功能受损,增加了动脉瘤、子宫破裂和肠道破裂等严重并发症的风险。
其他疾病:由于III型胶原蛋白与血管完整性密切相关,与COL3A1基因相关的其他疾病表型包括以额顶多小脑回为特征的脑部异常,以及多种纤维化疾病。在这些疾病中,多种器官中发现了III型胶原蛋白含量的增加,这导致严重的脑部畸形,影响正常的大脑发育或导致其他器官结构和功能的改变。
（二）III 型胶原蛋白参与其他胶原蛋白形成与作用过程
已有研究表明,III型胶原蛋白通过与其他型别的胶原蛋自相互作用以调节胶原纤维直径、参与胶原 纤维交联等。
调节胶原纤维直径：III 型胶原蛋白与 I 型胶原蛋白共同组装形成异质型 I/III 胶原纤维,控制胶原纤维直径。
部分加工的 III 型前胶原 (即 pN-collagen III) 可通过与胶原纤维形成共价聚合物来调节由 I 型胶原形成的胶原纤维的直径opN-collagen III 抑制 I 型胶原组装成纤维的速率,并减少被纳入纤维中的I型胶原的数量。
已有研究表明, III 型胶原蛋白的减少会导致关节软骨中胶原纤维增厚与异致性增加, 这表明在胶原蛋白 III 缺乏的情况下,原纤维 的生长受到了损害。
参与胶原纤维交联：III 型胶原分子与 I 型、 II 型胶原蛋白等以共价方式进行交联。
I、II、III、V、XI 和 IX 型胶原形成共价酶促胶原交联, 从而加强和成熟胶原网络。胶原蛋白的交联对胶原组织的拉伸性能很重要, 并且交联量在不同结缔组织中具有明显差异。
已有实验通过从人平滑肌瘤和牛主动脉的不溶性基质中, 分离出含有分子间交联的肽,通过一系列分离确认,证明了I型和III型胶原分子存在于同一胶原纤维中, 以OD错位(Out-of-D-phase displacement) 方式,通过分子间交联连接。
（OD错位是指在胶原分子组装成纤维时,相邻分子之间的错位排列方式。在胶原纤维结构中,胶原分子以三螺旋的形式存在, 每个螺旋被称为一个单体 这些单体在形成胶原纤维时,会以一定的错位方式排列,以增强纤维的整体稳定性和力学性能）
另有实验发现,具有未加工N-前肽的III型胶原蛋白分子以共价交联聚合物形式存在于成年人类与牛关节软骨的细胞外基质中,并且与II型胶原蛋白广泛交联。作为一种共价修饰剂,III型胶原蛋白可能在软骨细胞对基质损伤的修复过程中发挥作用,为已经受损的II型胶原蛋白纤维网络提供额外的凝聚力,从而加强这一网络的结构稳定性。
III 型胶原蛋自序列中包含细胞表面受体识别位点,可通过与整合素等的作用促进细胞粘附、迁移、增殖等过程。
（三）III 型三螺旋胶原蛋白促进细胞粘附、迁移与增殖
整合素是介导细胞粘附的异二聚体跨膜受体通过细胞外头部区域,大多数整合素结合细胞外基质糖蛋白(如层粘连蛋白和基底膜 上的胶原蛋白)或结缔组织成分(如纤维连接蛋白)。另一些则与邻近细胞、细菌多糖或病毒外壳蛋白上的反受体结合通过这些相互作用,整合素介导基底膜的稳定粘附、细胞外基质的形成和在这些基质上的迁移、血小板聚集体的形成、免疫系统中细胞间连 接的建立,以及传染病期间细菌和病毒的进入。此外, 整合素介导的粘附调节信号级联控制细胞运动、存活、增殖和分化。
III型胶原蛋白序列中包含促进细胞黏附和信号传导的关键位点,如GER或GEK整合素识别位点,它们存在于III型前胶原中,并显示出对结合整合素的高亲和力的位点位于C末端区域。
促进细胞粘附：
研究人员通过对正常培养的NIH/3T3细胞进行实验, 评估了重组 III 型三螺旋胶原蛋白的细胞黏附活性该实验采用了荧光法检测黏附活性,并设置了多个实验组,包括单链蛋白组、三螺旋蛋白组、对照组以及空白对照组培养一段时间后,通过计算细胞粘附率来反映胶原蛋白样品的细胞黏附活性,粘附率越高,表明蛋白黏附的细胞越多,黏附活性越强。
研究结果显示,III型胶原蛋白具有促进细胞粘附的功能,并且重组III型三螺旋胶原蛋白的细胞黏附活性优于单链胶原蛋白和对照组,这表明重组III 型三螺旋胶原蛋白能够在短时间内促进细胞贴壁或黏附于细胞外基质, 有助于构建更适宜的细胞外环境。
促进细胞迁移：
研究人员取重组III型三螺旋胶原蛋白纯化冻干品、对照III型单链胶原蛋白及牛血清白蛋白培养状态良好的BALB/3T3细胞。并在培养不同时间进行取样、拍照、分析计算迁移率。 在此实验体系中, 细胞迁移活性可以有效表征胶原蛋白生物学活性的指标, 迁移率越高,速度越快, 胶原蛋白的生物学活性越佳。
研究结果显示, III型胶原蛋白可促进细胞迁移,且重组III型三螺旋胶原蛋白比III型单链胶原蛋白更优的细胞迁移活性。
促进细胞增殖：
研究人员通过测定吸光度的方法研究了重组III型三螺旋胶原蛋白与单链胶原蛋白对小鼠胚胎成纤维细胞3T3活力的影响, 对其细胞毒性与促成纤维细胞增值进行了评价研究人员收集指数生长期的细胞, 分别使用重组 III型三螺旋胶原蛋白与单链胶原蛋白培养, 用多功 能酶标仪统计分析各组的细胞活力。
研究结果显示, III型胶原蛋白促进了3T3细胞的增殖活性, 并且,重组III 型三螺旋胶原蛋白对3T3细胞具有显著安全性及明显的强于单链蛋白的的促进增殖活性的作用。
（四）III 型胶原蛋白参与促进伤口愈合
伤口愈合涉及止血、炎症、增殖与重塑4个阶段, III型胶原蛋白在各个阶段发挥重要作用,最终使伤口恢复正常生理状态。伤口愈合是一个复杂的过程, 通常包括4个阶段: 止血, 炎症,增殖和重塑。
止血：血小板是血液中的一种重要成分,当血管受损时,血小板会迅速聚集在损伤部位,形成血小板栓,堵住破裂口,并释放与凝血有关的各种因子,参与凝血级联反应,促进血液凝固。
根据Balleisen等人1975年的研究结果,III型胶原蛋白影响人类血小板的聚集。后续研究进一步对此结论进行了证实。现在已知血小板通过特定的糖蛋白和非整合素受体与III型胶原蛋白相互作用。2008年,Jarvis等人使用了57种合成肽,测试了它们与人类和小鼠血小板的相互作用能力。这些肽的序列源自COL3A1的序列,并且能够形成三螺旋结构结果发现含有三个羟脯氨酸残基的肽能够与血小板中的糖蛋白VI结合。
炎症：炎症是正常愈合过程中的关键阶段,在伤口的正常愈合中,及时解决炎症十分重要。炎症消退是一个动态过程,由促炎和抗炎反应的混合推动 根据一项使用稳定胶原蛋白基质的研究, 胶原蛋白会产生一种强大而急性的炎症反应,这种反应是短暂的,并且会迅速消退,从而促进伤口愈合。此外,胶原已被证明通过microRNA信号传导在抗炎、促血管生成伤口巨噬细胞表型中起关键作用。
增值：在炎症反应减弱和上皮层增厚之后,伤口内部的成纤维细胞开始增加,这些细胞负责合成和分泌胶原蛋白,并构建细胞外基质。随着愈合过程的进行,胶原纤维逐渐成为伤口中主要的结构成分,纤维束变粗,形成大量密集的胶原组织,即瘢痕。这些瘢痕有助于将断裂的组织重新牢固地连接在一起。由于胶原是赋予组织张力和强度的主要蛋白质,因此胶原的代谢在伤口愈合过程中具有关键性作用。
重塑：伤口初步修复后,内部结构需调整以恢复其生理状态新上皮逐渐成熟,深层上皮细胞溶解新生血管网减少并变成有规则的微血管系统。胶原纤维变得粗长、有序,抗裂强度提升。胶原在胶原酶的作用下维持较高的更换率,保持张力强度。
（五）III 型胶原蛋白与肿瘤
近年来的研究发现,III型胶原蛋白通过参与肿瘤微环境,可使肿瘤细胞维持休眠状态,从而抑制肿瘤增殖。
在原发肿瘤切除后,即使进行了术后辅助治疗,若未能彻底清除残留的肿瘤细胞,这些细胞可能会通过血液循环迁移至远处器官并定植,随后进入休眠状态在经过数年的潜伏期后,这些休眠的肿瘤细胞在特定条件的触发下会被激活,迅速进入增殖周期,最终形成明显的转移灶。由于进入休眠状态的肿瘤细胞其细胞周期停滞在G0/G1期,既不增殖也不凋亡,使得传统的放疗和化疗手段对其失效,从而大大增加了肿瘤彻底治愈的难度。
2021年,刊登在Nature Cancer上的文章探讨了扩散的肿瘤细胞如何感知并改造细胞外基质,以维持其休眠状态通过细胞外基质 蛋白质组学分析, 学者们发现休眠的癌细胞处于一个富含III型胶原的微环境中。这种由肿瘤细胞产生的III型胶原对于维持肿瘤休眠至关重要,一旦这种胶原网络被破坏,将通过DDR1介导的STAT1信号通路,促使肿瘤细胞重新进入增殖状态。
学者们利用二次谐波生成双光子显微镜技术, 观察到肿瘤细胞从休眠状态向激活状态的转变,伴随着III型胶原结构和含量的变化。临床样本分析显示, 与淋巴结转移阳性的患者相比, 淋巴结阴性的头颈部鳞状细胞癌患者的肿瘤中III型胶原水平有所增加。总而言之,这项研究揭示了肿瘤微环境对肿瘤细胞休眠的影响,并证明III型胶原蛋白在其中发挥重要作用, 向肿瘤微环境中添加III型胶原蛋白,能够促进肿瘤细胞进入并维持在休眠状态,抑制肿瘤增殖。
研究表明, III型胶原蛋白在肿瘤细胞休眠过程中扮演了关键角色,通过向肿瘤微环境中引入III型胶原蛋白, 可以有效促进肿瘤细胞进入休眠状态, 并保持其稳定,从而抑制肿瘤细胞的增殖活动,为肿瘤治疗提供了新的思路和方向。
三、III 型胶原蛋白与信号通路
III型胶原蛋白代谢的各通路之间纵横交错、相互影响,共同介导胶原蛋白代谢过程。
蛋白质代谢归根结底是从基因转录开始的，一般来说，基因的转录活性又受到许多顺-反式调控元件和细胞因子构成的信号通路的调控。近年来,纤维发生信号通路引起了人们的广泛兴趣,有研究发现,III型胶原蛋自代谢受 NF-kB、TGF-β/Smads、PI3K/Akt、ERK与Wnt等信号通路的调控。随着研究的深入,发现III型胶原蛋白代谢的各通路之间纵横交错、相互影响,共同介导胶原蛋白代谢过程。
NF-kB：NF-kB信号通路的活化机制为:IkBα发生磷酸化、泛素化后被降解,NF-kB二聚体被释放,使得NF-kB进入细胞核,引起基因转录。目前有学者研究证明,在III型胶原蛋白的mRNA表达中,组织蛋白酶B的表达能够慢性调控NF-kB信号通路,组织蛋白酶B能够直接降解IkBα,使NF-kB信号通路慢性活化,从而抑制III型胶原蛋白的mRNA表达。
TGF-β/Smads：转化生长因子TGF-β/Smads信号通路是调控纤维发生的经典途径,主要参与细胞外基质胶原蛋白的沉积,TGF-β是一种能够调节多种类型细胞生长、分化和功能的多功能细胞因子,其对间充质细胞的主要作用是刺激 ECM的沉积,TGF-β可诱导成肌成纤维细胞分化,增加III型胶原蛋白的表达,导致ECM中胶原蛋白沉积OTGF-β的活化及信号转导开始于配体二聚体与2个II型TGF-β受体(TGF-βRII)的结合,然后募集2个I型受体(TGF-βRI)使之磷酸化,构成具有丝氨酸,随之激活下游信号传导途径,TGF-βR II被认为是用来确定配体特异性的物质,若无TGF-βRII的帮助,TGF-βR ITGF-βTGF-βRII也不能单独传递信号,经激活后TGF-βRI对细胞内Smads转录因子表现出更高的激酶活性;被激活的TGF-βRI募集并磷酸化Smad2和Smad3然后与Smad4缔合形成易位复合物进入细胞核,在细胞核中,易位的异源复合物通过其他转录因子。(如Sp1)与靶基因结合,并与CBP/p300协同促进 III 型胶原蛋白 mRNA 表达。
ERK：ERK通路由ERK1和ERK2组成, Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径有研究表明ERK通路与胶原代谢相关,丝氨酸蛋白酶抑制剂 SERPINE2通过抑制ERK1/2通路和下游NF-KB转录因子来抑制MMP-13活性;如纤溶酶原激活抑制剂在抑制ERK1/2通路后,III型胶原蛋白的基因表达明显下降;抑制成纤维细胞ERK1/2通路后,发现成纤维细胞分泌III型胶原蛋白的能力明显下降。
Wnt：Wnt信号通路与细胞分化、生长、凋亡等过程有关,主要有Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+和Wnt/PCP3条胞内转导途径,Wnt/β- catenin通路是最经典的信号通路,其参与了人体肝、肺、肾等纤维化过程; 有学者将 β-cateninSiRNA 转染至肝星状细胞,发现III型胶原蛋白的合成明显下降; 应用Wnt通路拮抗剂DKK-1发现III型胶原蛋白减少o MMP-13是Wnt/β-catenin信号传导通路的下游分子,能裂解III型胶原蛋白; 更有研究发现β-catenin的过度表达会使软骨细胞中MMP-9、MMP-13基因表达明显增加,应用Wnt/β-catenin 通路中关键蛋白LRP5的抑制剂能够使软骨细胞 MMP-13 的 mRNA 表达量明显下降,从而减少III 型胶原蛋白的降解。
