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N6-甲基腺苷(m6A)是最常见的mRNA内部修饰，在调节植物生长中起着重要作用。然而，目前仍然缺乏有效的工具来精确修改植物中单个转录本的m6A位点。
2024年9月4日，华中农业大学金双侠及张献龙共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“CRISPR/dCas13(Rx) Derived RNA N6-methyladenosine (m6A) Dynamic Modification in Plant”的研究论文。该研究通过将CRISPR/dCas13(Rx)与甲基转移酶GhMTA(靶向RNA甲基化编辑器，TME)或去甲基转移酶GhALKBH10(靶向RNA去甲基化编辑器，TDE)相结合，开发出可编程的m6A编辑工具。
这些编辑器能够在0至46nt的广泛编辑窗口内，在内转录本GhECA1和GhDi19的目标位点上有效沉积或去除m6A修饰。TDE编辑器显著降低了m6A水平24%–76%，而TME编辑器增加了m6A富集，范围从1.37倍到2.51倍。此外，m6A修饰的安装和移除在调节GhECA1和GhDi19 mRNA 转录本方面起着相反的作用，这可能是由于它们的m6A位点位于基因的不同区域。最重要的是，用TME编辑植物靶向GhDi19转录本可显著增加根长并增强抗旱性。总之，这些m6A编辑器可用于研究特定m6A修饰的功能，并具有未来在作物改良中的应用潜力。
RNA是所有生物体的基本组成部分，它将遗传信息从DNA传递到蛋白质，在此过程中RNA转录本会发生各种修饰。RNA修饰，统称为表观转录组学，是一种复杂而动态的调控方式，最终决定细胞的命运和功能，体现在RNA水平和翻译的改变上。自20世纪50年代以来，已发现160多种修饰在真核RNA表观转录组途径中发挥重要作用，如N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和N1-甲基腺苷（m1A）。其中，m6A是真核生物mRNA中最丰富的化学修饰，也存在于多种细菌和RNA病毒基因组中。目前的研究表明，m6A参与多种mRNA代谢过程，调控RNA命运，是RNA转录后调控的主要机制之一。这些过程包括可变剪接、核-胞质输出、RNA稳定性、3′-非翻译区加工(3′UTR)、染色质调控和翻译效率。近年来，有关植物m6A修饰的研究有所增加。这些研究表明，m6A修饰在调节植物发育、果实成熟、光形态建成和抗逆性方面起着至关重要且广泛的作用。m6A甲基化发生在称为基序RRACH（R=A/G；H=A/C/U）的保守序列环境中，以及其他主要基序，例如植物特异性基序URUAY（Y=C/U）。大多数先前的研究表明，在哺乳动物和植物中，m6A位点富集在基因的终止密码子和3′UTR周围。值得注意的是，在应激反应转录本中观察到大量m6A峰，其中在基因的5′UTR或外显子区域富集。目前尚不确定不同区域（例如3′UTR或5′UTR）中的动态m6A修饰是否遵循类似的转录后调控机制。RNA m6A是一种动态且可逆的修饰，该机制由三个核心亚基组成，包括甲基转移酶“写入器”、脱甲基酶“擦除器”和结合蛋白“读取器”。在哺乳动物中，写入器是蛋白质复合物，包括甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)。先前的研究表明，METTL3或截短的METTL3和METTL14的复合物具有甲基转移酶活性，可在哺乳动物中甲基化腺嘌呤，而体外甲基化测定表明只有METTL3而不是METTL14具有催化活性。FTO和ALKBH5作为擦除器负责去除m6A修饰。在哺乳动物中已鉴定出不同类型的m6A识别蛋白，例如YTH（YT521-B）结构域家族蛋白和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BPs)。在植物中，已鉴定出两种类型的蛋白质：多蛋白写入复合物和FIONA1（人类METTL16的同源物）。这些蛋白质起着写入器的作用，负责在mRNA中安装m6A修饰。然而，FIONA1的底物尚未完全阐明。多蛋白写入复合体包括MTA（人类METTL3的同源物）、MTB（人类METTL14的同源物）、FIP37（人类WTAP的同源物）和VIRILIZER（人类VIRMA的同源物）。在擦除蛋白方面，有13个ALKBH同源蛋白，其中5个（ALKBH9A/9B/9C/10A/10B）与拟南芥中的ALKBH5同源。值得注意的是，FTO在植物中没有同源对应物。迄今为止，ALKBH9B和ALKBH10B的去甲基化酶活性已在植物中得到证实。进一步研究证实，ALKBH10B可以作为一个真正的m6A去甲基化酶发挥作用。此外，SlALKBH2也被鉴定为一个RNA m6A去甲基化酶，定位于番茄的内质网。对植物中m6A读取器的研究有限，主要集中在YTH结构域蛋白上。植物中可编程m6A编辑工具的设计（图源自Advanced Science ）通常，由于植物中缺乏RNA生物学工具，对m6A对各种生物过程和表型影响的研究依赖于对m6A写入器、擦除器和读取器的全局操纵。然而，m6A修饰系统的任何关键成分的添加或删除都会导致m6A修饰总体水平发生大量、非特异性变化，并产生不可预测的影响。此外，单个转录本特定区域的m6A去甲基化（甲基化）过程可能具有不同的影响，特定m6A修饰与下游表型变化之间的因果关系仍不清楚。因此，开发一个多功能的m6A编辑平台至关重要，该平台不会改变底层基因序列或m6A修饰的整体范围。这对于研究单个m6A修饰位点的意义和了解特定RNA甲基化事件在植物中的影响至关重要。表观基因组编辑提供了一种直接研究表观基因组修饰功能含义的新方法。该技术涉及将表观遗传酶（例如writer或erasers）与CRISPR/dCas9（死Cas9）融合，以在特定DNA位点诱导靶向表观遗传修饰。已证明CRISPR/Cas13能够在生物过程中实现精确的RNA编辑和RNA修饰，包括亚型VI-A（Cas13a，1250aa）、VI-B（Cas13b，1150aa）、VI-C（Cas13c，1120aa）、VI-D（Cas13Rx，930aa）、VI-X（Cas13X，790aa）和VI-Y（Cas13Y，792aa）。与Cas9介导的DNA编辑技术相比，Cas13蛋白的特点是其物理尺寸更小，并且具有更广泛的原间隔区相邻基序(PAM)。Cas13能够选择性地、可逆地修饰RNA，而不会引起基因组的改变。最近，一些研究已成功利用CRISPR/dCas13（死Cas13）在细菌、哺乳动物细胞和拟南芥中开发出可编程的RNA m6A或m1A甲基化或去甲基化系统。需要强调的是，动物研究中的一些发现可能并不容易应用于植物系统。对于基因组更复杂的植物物种来说，低概率和不稳定的基因编辑事件的发生被认为是不一致的。此外，外源去甲基化酶对植物发育有显著的影响。目前，植物中仍然缺乏动态可逆的甲基化或去甲基化编辑器，目前还没有关于在生物体水平上精确操纵单个m6A水平进行表型研究的报道。最重要的是，不同转录本的3′UTR、CDS和5′UTR区域中发生的m6A修饰是否表现出可比的转录后调控模式以及它们如何调节转录本代谢仍不确定。在本研究中，作者通过将CRISPR/dCas13(Rx)与去甲基转移酶GhALKBH（靶向RNA去甲基化编辑器，TDE）或甲基转移酶GhMTA（靶向RNA甲基化编辑器，TME）相结合，开发并优化了可逆的m6A编辑器。这些m6A编辑器是在植物中构建的，可以有效地修改棉花植物中各种内转录本内的特定m6A位点。这些编辑器允许在0到46nt的广泛编辑窗口内成功沉积或去除GhECA1和GhDi19转录本的目标m6A位点上的m6A修饰。靶向位于GhECA13′UTR和GhDi195′UTR的m6A峰位点可以改变它们的m6A富集水平，导致mRNA的转录后调控相反。此外，作者发现TME编辑的GhDi19转基因植物的根长显著增加，耐旱性增强。这些结果表明这些m6A编辑器可用于探索特定m6A修饰的功能，并具有未来作物改良的潜在应用价值。https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202401118![]()
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