![]()
羽扇豆的蛋白质作物被培育成积累低水平的抗营养生物碱，忽视了它们作为有价值代谢物来源的潜力。窄叶羽扇豆(NLL)积累大量的工业利用价值的生物碱，称为(-)-sparteine。虽然(-)-sparteine被认为是手性合成中的关键辅助分子，但其可变的价格和有限的可用性阻碍了其大规模使用。有两种酶可以启动(-)-sparteine转化为NLL中积累的各种生物碱。第一个是属于71家族的细胞色素P450单加氧酶(CYP71D189)，第二个是短链脱氢酶/还原酶(SDR1)。通过筛选一个非转基因NLL突变文库，并在CYP71D189中分离出一个敲除。基因敲除显示出代谢谱的改变，其中(-)-sparteine占种子中生物碱含量的96% (GC-MS基础)。从突变体种子中分离的(-)-sparteine是对映体纯的(99%对映体过量)。除了改变的生物碱谱外，突变体没有任何明显的表型。表明(-)-sparteine是NLL中大多数QAs的前体，并扩大了NLL作为作物的当前用途。![]()
近日，国际著名杂志Plant Biotechnology Journal上发表了一篇为“Metabolic engineering of narrow-leafed lupin for the
production of enantiomerically pure (-)-sparteine”的研究文章，野生羽豆积聚大量喹诺齐啶生物碱(QAs)，通过使用最先进的植物育种技术来设计NLL中QAs的天然生物合成途径，以生产具有商业价值的(-)-sparteine，这是不对称化学合成领域的关键分子。具体来说，sparteine和锂之间的配合物已被证明在常见的不对称过程中是极其重要。最初，只有(-)-sparteine在商业上可用，在每种情况下只能实现两种可能产物中的一种的不对称合成。这导致了一种具(+)-sparteine预期功能的可合成分子的发展，这种分子后来被称为(+)-sparteine。
羽扇豆素通常会积累复杂的QAs混合物，包括双环、三环和四环。从结构上看，sparteine是最简单的四环QA。羽扇豆素衍生的QA的对映体纯度与物种有关。而同样的QA在窄叶羽扇豆中似乎只以右旋形式出现。(图1)。![]()
（图1）
由于参与特定代谢物通路的基因倾向于共表达，通过使用了可用的转录组学数据集选择了三种表达模式与已知QA途径赖氨酸脱羧酶(LDC)相似的氧化酶候选物，并通过农业渗透在烟叶中单独表达。与阴性对照(GFP)相似，表达CYP76E36和CYP71A168的叶片似乎不能代谢单独浸润的(-)-sparteine。相比之下，表达CYP71D189的叶片在(-)-sparteine浸润后产生了假定的双氢-parteinium离子（图2）。
![]()
（图2）
SDR1和CYP71D189在benthamiana叶片中的共表达导致(-)-sparteine浸入后二氢-drosparteinium离子水平降低，并出现(+)-lupanine，认为SDR1作用于CYP71D189的直接产物2-羟基sparteine。（图3）
![]()
（图3）
CYP71D189和SDR1在以(-)-sparteine为代表的主要QA途径以及以(-)-α-isosparteine为代表的次要QA途径中起作用。此外，认为(-)-multiflorine是由(-)-sparteine或相应的二价阳离子前体生成的(-)-sparteine。研究结果证实了(-)-sparteine的中间作用(图4)。![]()
（图4）
通过对纯化的(-)-sparteine进行了手性GC-MS分析，结果显示其对映体过量高于商业标准，最后，我们从较大的M6分离出(-)-sparteine，包括结晶，作为亚硫酸盐。在这种情况下，平均产率为0.3%，非手性气相色谱-质谱分析纯度为98%，手性气相色谱-质谱分析纯度为99%。（图5）。![]()
（图5）
本研究的的CYP71D189KONLL突出之处在于我们的目标代谢物(-)-sparteine先前不存在于原始植物中。还证明了FIND-IT技术的潜力作为CRISPR-Cas9的替代品，用于植物代谢工程，其中转化是前所未有的或技术上具有挑战性的。原文链接:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14509
本公众号免费发布招聘信息和宣传科研成果
已推送文献可提供PDF，如有需要，文章后留言即可
欢迎联系微信：506911145 或邮箱506911145@qq.com
