在棉花种植中，雄性不育性是一种重要的农艺特性，用于生产高效的F1杂交种以利用杂种优势。此研究结合了雄性不育基因和除草剂抗性标记基因，实现了雄性不育系的高效筛选。这种可逆雄性不育系统不仅可以与其他雄性不育诱导基因结合使用，还具有广泛的适用性。通过这种方法，能够有效解决雄性不育和生育恢复的相关问题，而不需要额外的特定恢复基因。该技术在棉花的应用展示了其经济可行性，并能够在保持雄性亲本的商业化生产的同时，提高生产效率。本研究的研究成果为棉花等作物的杂交种生产提供了一种创新的解决方案，有望在未来大规模推广，促进农业的可持续发展。来自于印度国家植物研究所的研究人员，使用雄性不育-生育恢复系统已成为提高作物产量的关键技术，通过利用杂交优势可提高作物产量15%至50%。为了解决在雌性亲本中实现完全的雄性不育以及在F1杂交种中完全恢复生育力的挑战，本研究开发了基于转基因的可逆雄性不育系统。本研究利用拟南芥的自噬基因AtBECLIN1/ATG6和E3泛素连接酶COP1的突变体COP1L105A，设计了一种新的雄性不育和生育恢复机制，并将其应用于经济重要的棉花作物。本研究的系统通过特定的启动子在绒毡层特异性过表达BECLIN1，延迟绒毡层的程序性细胞死亡（PCD），从而诱导雄性不育。为了恢复F1的生育力，本研究在RS（恢复系）植物中表达COP1L105A，该基因能够特异性降解与BECLIN1交互作用的蛋白质，从而取消BECLIN1的表达，恢复花粉的正常发育和生育能力。此外，本研究通过结合抗除草剂基因，简化了非转基因事件的筛选过程，确保了商业生产线的经济可行性。这一技术不仅提高了棉花的田间表现，还为其他自花授粉作物提供了一种通用的雄性不育诱导技术。本研究开发了转基因棉花系列，通过农杆菌转化方法将雌性（MS）和恢复雄性（RS）基因构建导入棉花（Coker 312）。共生成了多个转基因和非转化的对照（WT）体细胞植株。在控制条件下，54株MS（雄性不育）植株中有32株表现出完全的雄性不育，22株为半不育。所有表达COP1L105A基因的T0 RS（恢复系）线均展示了与野生型类似的正常花朵大小、完全的花药开裂和花粉活力。MS植株表达BECLIN1基因后，其花朵体积小，花药不开裂且充满无活力的花粉。与此相对，RS线的花朵则显示出较大的花朵，花药开裂含有活力的花粉，类似于野生型。进行了严格的筛选，只有完全雄性不育的MS线被选用进行进一步分析。RS线的正常花粉生育导致了正常的棉铃发育，与野生型相似。而具有不育花粉的雌性花朵则会收缩并脱落，不形成棉铃。通过野生型花粉与不育花交配，MS线被保持并推向下一代。与野生型相比，MS和RS的T1-T2代及其F1（MS × RS）后代种子显示出典型的种子发芽率。此外，通过PCR和植物选择标记（MS使用BASTA，RS使用潮霉素筛选幼苗）基于筛选确认了转基因在后续几代中的存在和稳定的孟德尔遗传。棉花转基因线特别表达AtBECLIN1后，其花药不开裂并且失去花粉活力。与MS线相比，RS线花朵较大，花药开裂，含有活力的花粉，与野生型相似。在MS花药中，与野生型和RS相比，通过草酚酞-HCl染色的前一天花蕾显示出更高的木质素沉积。此外，经过脱水处理的草酚酞-HCl染色的WT和RS花药在室温下开始破裂，而与此同时，MS花药则收缩，这表明MS花药中填充的是无法产生足够力量以实现花药开裂的不育花粉。![]()
Fig1: AtBeclin1表达引起的棉花雄性不育图
(a) 整株植物表型，包括：(i) 对照（WT）植物，(ii) 表达AtBeclin1的雌性（MS）植物，以及(iii) 表达AtCop1的雄性（RS）植物。(b-m) WT、MS和RS系列植物之间的花朵、花药和花粉形态比较，其中(b-d) WT花朵展示花药开裂和有活性花粉，(f-h) MS花朵花药不开裂且花粉不育，(j-l) RS花朵花药开裂且花粉有活性。使用Phloroglucinol-HCl染色的-1 DPA花药样本来自(e) WT，(i) MS，和(m) RS植物。
(n) 利用定量实时PCR技术分析AtBeclin1在MS植物的不同花药发育阶段及植物部位的表达情况。GhUBI 14（泛素）被用作内部参考对照。
(o) 在WT和MS中比较四分体花粉、成熟花粉和-1 DPA花芽花药开裂表型，其中(i, ii) 四分体花粉，(iii, iv) 成熟花粉，以及(v) WT花药完全溶解气孔膜（绿色箭头），(vi) MS花药气孔膜完全完好（红色箭头）。
通过农杆菌介导法将雄性不育（MS）基因构建体和恢复雄性不育（RS）基因构建体分别转化到棉花（Coker 312）中，成功获得了多个转基因棉花和非转化对照（WT）植物。在控制条件下，共获得54株MS植物、11株RS植物、PCR阳性T0代植物以及18株非转化对照（WT）植物。在这54株T0代MS植物中，32株表现出完全雄性不育，22株表现为半不育。所有表达COP1L105A转基因的T0代RS植物均表现出正常大小的花朵，花药完全裂开，花粉具有活力，与WT植物相似。相比之下，表达BECLIN1的MS植物表现出小型花朵，花药不开裂，内部充满无活力花粉；而半不育植物则表现为活力和无活力花粉混合的状态。本研究剔除了所有半不育的MS植物，只选择表现完全雄性不育的MS系进行进一步分析。RS植物的正常花粉生育力导致了正常的花蕾发育，类似于WT植物。相反，雌性花朵由于不育的花粉而萎缩并掉落，未能发育成果实。MS系通过与WT花粉交配，保持并推进到下一代。与WT植物相比，MS和RS（T1–T2）代以及它们的F1（MS × RS）后代种子显示出典型的种子发芽率。此外，通过PCR和植物筛选标记（MS系使用BASTA，RS系使用庆大霉素）筛选，确认了转基因在MS、RS以及F1代植物中的稳定存在及孟德尔遗传规律。该研究表明，转基因棉花系成功地实现了雄性不育和生育力恢复的稳定遗传，为棉花杂交种的生产提供了有效的基因工具。
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Fig3：AtBeclin1介导的后减数分裂期绒毡层程序性细胞死亡（PCD）的延迟，导致了早期花粉流产和随后的花药不开裂。
(a-c) 从不同花药发育阶段获取的半薄切片（石蜡包埋10微米切片）显示了控制组（WT）(a, i-vii)、雌性（MS）(b, i-vii) 和 F1 (MS × RS)(c, i-vii) 的绒毡层PCD。
(d) 成熟花药的内皮层次级细胞壁（ESW）增厚和定向，在 WT (i)、MS (ii) 和 F1 (MS × RS)(iii) 中展示。
(e) Phloroglucinol-HCl染色的雌性（MS）-1DPA花蕾花药和切片 (i, ii) WT, (iii, iv) MS 和 (v, vi) F1 (MS × RS)。
(f) WT、MS 和 F1 (MS × RS) 的-1 DPA花蕾花药切片中的内皮层厚度。
(g 和 h) 条形图表示成熟花药（-1DPA）和幼叶中木质素含量的定量估计。
(i) 条形图显示WT、MS 和 F1 (MS × RS) 的不同花药发育阶段中GhNST1基因的qRT-PCR表达分析。TS表示四分体阶段；TDS表示绒毡层退化阶段；ADS表示花药开裂阶段；E表示表皮；En表示内皮层；Ml表示中层；T表示绒毡层；Tds表示四分体；Msp表示小孢子；aMsp表示异常小孢子；Ps表示花粉囊；PG表示花粉粒；aPG表示异常花粉粒；St表示孔膜；Sm表示隔膜。
BECLIN1基因的表达在棉花中引起了绒毡层程序性细胞死亡（PCD）的延迟，这进而导致了早期花粉的流产以及花药的不开裂。在MS（雄性不育）植株中，内皮层次级细胞壁的增厚显著，与野生型（WT）相比，这种现象在F1代（MS × RS）中被纠正。此外，木质素沉积在MS花药中明显增多，而在F1代中则恢复至接近WT的水平。这些变化与NAC次级壁增厚促进因子（NST1和NST2）的表达调控相关，这些转录因子控制着次级细胞壁的生物合成，进而影响木质素和纤维素的合成。在显微镜分析中，观察到MS花药中的绒毡层退化延迟引起的花粉形态异常，而通过在F1代中表达COP1L105A抵消了BECLIN1的效应，从而恢复了花粉的正常发育，与WT相似。这些发现揭示了植物雄性生殖发育中BECLIN1的关键作用及其通过改变活性氧平衡和抑制绒毡层PCD引起的早期花粉异常。
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Fig4: AtBECLIN1通过影响活性氧平衡和抑制绒毡层程序性细胞死亡（PCD）引起发育中花粉粒的缺陷。
(a–c) 在不同花蕾发育阶段（从四分体花粉到成熟二核花粉）的花药及其相应花粉粒表型，包括 (a) 对照（WT），(b) 雌性（MT），和 (c) F1（MS × RS）。
(d–f) 在不同花药发育阶段的ROS（H2O2）积累水平比较，涉及 (d) WT，(e) MS，和 (f) F1（MS × RS）。
(g–i) 通过TUNEL检测（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记）在WT，MS 和 F1的不同花药发育阶段中的绒毡层PCD，显示了在MS和F1中分别抑制和恢复的PCD，与WT相比。
在BECLIN1基因通过影响ROS（活性氧）平衡和抑制绒毡层程序性细胞死亡（PCD），导致了发育中花药中花粉粒的缺陷。特别地，MS（雄性不育）植株的花药在四分体和早期绒毡层退化阶段显示出显著降低的ROS积累，而成熟花药则展示出相较于WT（野生型）更高的H2O2水平。与MS相比，F1（MS × RS）植株在绒毡层退化和花药开裂阶段的ROS积累模式与WT类似，表明恢复的生育能力。此外，通过TUNEL检测显示，WT的花药在8-15mm花蕾阶段绒毡层细胞核展示出PCD信号，而MS花药缺乏这些信号，F1示例中的花药则显示出正常的PCD。在温室环境下，对不同T3代RS和T4代MS线，及其F1和F2植株进行了详细的表型和生殖分析。研究发现，转基因植株与野生型相比，在早期开花阶段显示出可变的叶片数量，且在生理性状如蒸腾作用、气孔导度、光合作用和水分利用效率方面没有统计学意义上的变化。在植物发育的后期阶段，表达BECLIN1的MS线（如MS182和MS3）显示出较WT明显更高的植株高度、节位数、分枝数和茎直径，而一些RS和一种F1杂交种（MS182 × RS3）则展现出更旺盛的营养生长。关于生殖性能，F1杂交种在铃果设置方面展现出正常恢复的雄性生育能力，而MS转基因植株则由于花粉不可育展示出更多无铃果发育的花。然而，在生长季节末，雄性不育现象时而中断。此外，表达COP1L105A的RS和F1转基因体在成熟、未开和已开放的棉铃大小上，与WT相比，表现出显著增加的铃宽和长度。这些转基因体（RS，F1和F2）显示出除了RS9外，开放铃重量显著增加，而种子数量则有所差异。种子尺寸（长度和宽度）、绒毛含量和种子设置率在转基因植株中也显示出与WT相比的标准化增长。在收获时期，随机选择的植株表型（MS，RS和F1）也观察到在植株高度、分枝数、茎直径和总鲜生物量上有显著增加。![]()
Fig5: 在受控条件下比较控制组与转基因植物不同农艺性状的对比分析。
(a-d) 分别展示控制组（WT）、雌性（MS）、雄性（RS）和F1（MS × RS）的整株植物表型。
(e-v) 包括各种表型和生殖参数：(e) 植株高度，(f) 节位数，(g) 分枝数，(h) 茎直径，(i) 花朵数量，(j) 每株棉铃数量，以及(k和l) 转基因体相较于WT的雄性不育比例和恢复生育能力。
(p-v) 在WT和表达Cop1的转基因体（RS, F1和F2）中，对50颗种子的总纤维和种子产量进行比较分析。
本研究成功展示了在棉花中应用的可逆转基因雄性不育系统，这种系统具有重要的经济意义。通过结合细胞质雄性不育（CMS）和基因雄性不育（GMS）技术，本研究的方法主要应用于中国和印度的商业棉花种植。独特的是，该系统结合了多种雄性不育基因，并无需特定的恢复基因，这一点与传统的Barnase-Barstar系统或CMS系统中的核恢复系不同。此外，该研究还通过向雌性基因盒中加入抗除草剂基因BAR，赋予植株对除草剂BASTA的耐受性，使得转基因植株在早期植物发育阶段就能通过喷施BASTA来区分雄性不育与育性植株，简化了筛选过程。在玻璃温室和网室条件下的实验验证表明，该系统在控制植株性状和生产力方面表现出高度的可控性和稳定性，特别是在植株生长、花朵发育和纤维产量方面。这种系统不仅为棉花提供了一个可靠的雄性不育和恢复机制，也为其他重要经济作物的杂交种生产提供了潜在的应用前景。并且未来可以在其他商业重要作物中使用。原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14518
