近日，南方科技大学朱健康院士团队在 Cell Research在线发表题为“Structure and genome editing activity of the novel CRISPR-Cas12o1 effector”该研究成功开发了一类能在人类细胞以及单双子叶植物中进行高效基因组编辑的新型紧凑型CRISPR-Cas12o系统。
图1 Cas12o1的生化特征测试
图2 Cas12o1的三维结构和关键氨基酸残基
根据Cas12o1的结构信息，研究人员对Cas12o1进行蛋白改造，首先选取了核算识别区域带负电的氨基酸（D/E）突变为带正电的氨基酸（R）发现E100R活性对比野生型提升了5倍，随后进行饱和突变，发现E100K（Cas12o v1）的编辑效率对比野生型提升到了8倍左右。随后，研究人员解析了E100K的三维结构，发现E100K突变后增加了与PAM序列ATG中G的结合能力（由5 Å到3.5 Å），提升了双链的解旋能力从而提升了基因编辑效率。
在Cas12o v1的基础上，研究人员通过对与核酸互作的氨基酸，Nuc结构域的氨基酸以及同源氨基酸进行替换，利用荧光报告系统进行筛选，最终获得了Cas12o1 v2（E100K/S400R/L763R/S45T）。在293T细胞30个内源靶点的测试中，Cas12o1 v2的编辑效率与Cas9效果相当，并且能够识别更广泛的PAM序列, 我们将Cas12o1 v2 命名为Cas-SF02。Cas12o1 v2在植物（水稻稳定转化和大豆毛状根系统）中的基因编辑效率对比Cas12o1 WT和v1显著提高，最高编辑效率可达80%。综合而言，该研究鉴定Cas12o新家族，解析了Cas12o1识别切割靶向序列的机制，通过蛋白定向进化技术极大提升了Cas12o1的基因编辑活性，为动植物基因编辑研究提供了新的工具。
图3 Cas12o1的定向改造和在动植物细胞中活性测试
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