一、配胶
注意事项
1、需留意配胶试剂的有效期和清澈度，一旦发现沉淀或结晶，要及时更换。
2、需注意pH8.8Tris-HCl和pH6.8Tris-HCl可能会产生沉淀，根据需要选择1.0M或1.5M的浓度。在低温下（4度以下）存放的10%SDS易结晶。30%丙烯酰胺需在避光的情况下存放在4度以下。APS具有活性，室温下容易失效，建议配制后分装并冷冻保存在-20度的冰箱中。TEMED有刺鼻的气味和挥发性，对神经有毒，使用时请在通风良好的环境下，并避免暴露在空气中。
3、插梳子时，可斜着插，以避免有气泡的产生。
4、注意防止胶条老化和干燥，注意电泳结束后，将胶条放置在实验台上晾干，以确保其干燥。若胶条老化、出现裂纹，可以在上面放置保鲜膜进行保护，这样不仅可以有效防止胶液泄漏，还可以延缓胶条老化。
5、胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。
常见问题分析
1、漏胶
原因：玻璃板没对齐或玻璃板底部缺损，厚玻璃板边条密闭性不良，塑料夹子太松。
解决办法：确保玻璃板干燥，因为潮湿的玻璃板会产生很强的吸附力，使其对齐变得困难。正确的操作技巧是：一手用食指指腹按压厚玻璃板的一侧上缘，同时用拇指指腹按压薄玻璃板同侧的上缘，然后同时向下按压这两个指头，另一只手则锁定同侧的锁扣，然后重复相同的步骤锁定另一侧。
2、胶未凝固
原因：APS失效或TEMED失效或者胶在未完全凝固时被移动。
解决办法：确认试剂的有效性和配比是否正确，并确保混合均匀。如果配比正确但胶仍未凝固，可以考虑增加凝固剂的用量或延长凝固时间。
3、胶中存在气泡
分为两种情况，一种是胶底部出现气泡，原因可能是由于胶垫材质或梳子插入不当所致，可考虑改用实心软胶垫或添加保鲜膜。另一种情况是梳子下缘出现气泡，解决方法是先插一侧梳子再插另一侧。
4、拔梳子后泳道有胶丝
原因：TEMED用量过多导致胶凝固过快。
解决方法：减少TEMED用量。
5、拔梳子后泳道歪斜
原因：梳子与玻璃板不匹配。
解决方法：在灌胶前先测试梳子是否与玻璃板匹配。
二、电泳阶段
注意事项
1、确保上样体积一致，以免蛋白条带出现不同水平。空置的加样孔需添加相等体积的1×loading buffer，避免相邻通道蛋白样品扩散。在上样过程中，缓慢添加样品，避免快速吹打导致溢出，且上样体积应小于上样孔的总容积。
2、电泳液应在内槽填满，外槽填至1/4处。1.0mm厚的玻璃板最多可点样20μL，1.5mm厚的可点样40uL。
3、根据温度选择浓缩胶的电压，夏季室温较高时电压应较低，冬季相反。分离胶固定电压为150V高电压。调节电压时间可参考marker，若marker分开，表示蛋白已进入分离胶。夏季温度较高时，应将电泳槽放入冰水中降温，以防止凝胶变形。
常见问题分析
1、电泳带出现扭曲或歪斜
原因：电泳槽内的电泳液未完全加满或发生了漏液现象。
解决办法：及时补充电泳液，可以逐渐纠正条带的走向。
2、出现拖尾现象
原因：样本未能充分溶解。
解决办法：在确保样本溶解均匀后再进行上样操作，可以有效减少拖尾现象的发生。
3、电泳带向两侧扩散
原因：上样量过多所致。
解决办法：可适当减少上样量，以有效控制电泳带的扩散范围。
4、底部的溴酚蓝呈现笑脸状
原因：制胶试剂温度过高或制完胶后未及时保湿，导致胶层不均匀。
解决办法：可以降低电压并调节电泳速度，以确保在冰浴条件下进行电泳，以减少胶层的不均匀情况。
5、条带不整齐
原因：胶凝固不均匀；胶的下边缘出现气泡；上样buffer的浓度不正确；拔梳子时的不当操作。
解决办法：建议在胶完全凝固后再进行上样，以确保最佳结果；在进行电泳前仔细检查并清除胶底部的气泡；重新配置适合的上样buffer；可水平缓慢地拔出梳子，以确保样品孔的均匀性。
6、条带过粗
原因：可能是上样量过大；浓缩胶未浓缩好；浓缩胶pH值不正确；电压过高。
解决方法：减少上样量；增加浓缩胶长度；保证浓缩胶的pH正确（6.8）；降低电压。
本文作者是"小米"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：小米
校对：煲仔饭
素材：Canva
参考资料：
https://zhuanlan.zhihu.com/p/661467083
https://images.app.goo.gl/KtKVEC6c5uTBTFLc7
https://images.app.goo.gl/L5vo9RrQnCLPcWTC8
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