类比与RT-qPCR实验，Westen blot实验是从蛋白水平检测基因的表达情况，而在检测过程中内参基因的表达是相对恒定的，因此我们在探究目的基因受实验处理影响表达时需要挑选适合的目的基因作为内参，再进一步与实验对照组比较目的基因的相对表达量。
目前在实验中比较常用的内参基因主要为GAPDH（36KDa）、β-actin（42KDa）、β-tubulin（50-55KDa）。
（1）GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是在细胞代谢糖酵解中起关键作用的酶，由4个30-40kDa的亚基组成，检测条带大约在36kDa，通常表达量较高，在相同的细胞或组织中的表达量比较恒定。但是在缺氧和糖尿病等疾病情况中，GAPDH表达可能会发生变化，因此在这些情况下不推荐作为内参。
（2）Actin（肌动蛋白）
Actin是构成细胞骨架的主要蛋白之一。最常用作内参蛋白的是β-actin，检测条带大约在分子量42kDa。在许多真核细胞中都有广泛且稳定的表达，适用于全细胞和细胞质样品。
（3）Tubulin（微管蛋白）
Tubulin是构成微管网络的重要蛋白。最常用作内参蛋白的是β-tubulin，检测条带大约在55 kDa。微管蛋白与维持细胞形态和分裂过程有关，因此它的表达水平可能受细胞状态变化的影响。抗生素和抗有丝分裂耐药的细胞，Tubulin微管蛋白表达可能存在差异，即耐药性研究可能不建议用Tubulin作为内参蛋白。
在保证上样量一致的情况下，相对于对照组，实验组目的蛋白的表达水平是否有差异。挑选原则如下：
1、针对样本而言
首先考虑样品的物种来源、目的蛋白的表达部位例如全细胞、细胞核、细胞质、细胞膜或者血清 、血浆样本等。一般地，哺乳动物的细胞或者组织样本选择GAPDH、actin、tubulin（全细胞）、ATP1A1（细胞膜蛋白）、Histone H3（核蛋白）、Lamin（细胞核摸）、COX412（线粒体）、Albumin（全血、血浆、血清）作内参。而一些稀有物种具体需要通过查阅文献选择比较保守的管家基因作为蛋白内参。
2、蛋白分子量选择
（1）原则上选择的内参与通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 KDa以上
例如PTEN(47-55KDa)，此时内参选择GAPDH比较合适，NF-κb（65-70KDa）,此时β-actin较合适，GAPDH也可以；另外若是分子量为42-45kDa，此时不适宜选择β-actin 作为内参，可以考虑选择GAPDH或β-tubulin作为内参。另外两种内参也是相同情况。
（2）内参和目的蛋白也不是相差越大越好
1）转膜时间不好控制，若内参太小，目的蛋白太大，会导致内参转膜过度或者目的蛋白未完全转上。此情况需要分开转膜。
2）保证稳定性，内参蛋白需要在不同样本中稳定表达，以确保实验结果的可靠性。如果内参蛋白的表达水平与目的蛋白相差过大，可能会对目的蛋白的检测产生干扰。
3）另外若是同时处理多个样本，将目的蛋白和内参分开进行检测可以同时处理多个样本，提高实验效率。如果内参和目的蛋白的表达水平相差过大，可能需要调整上样量和抗体浓度，这可能会降低实验效率。
3、细胞 、组织特异性
在选择内参时，在考量实验条件和研究背景下，不同的细胞类型和实验目的可能需要不同的内参。例如我们在做多细胞、多组织样本或者动物实验样本对比表达量时，GAPDH作为内参是比较合适，因为GAPDH作为细胞代谢过程中 关键酶类蛋白，在组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是细胞骨架成分的 结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。
4、内参带条齐、目的蛋白有趋势
基本前提：（1）内参选择正确（2）上样量一致
注意事项：目前我们在进行Westen blot实验室倾向于裁剪NC膜或者PVDF以减少整膜孵育抗体和洗膜的麻烦。根据经验来看，内参抗体和目的蛋白抗体的蛋白分子量可能处于一个区间并不是一个准确的位置，即存在理论位置和实际观察位置 ，在阅读抗体说明书时我们一般会使用抗体的实际观察位置，否则就会因裁膜不当造成条带不全，或者条带位置不正确。但是近些年许多杂志都要求整膜不允许裁膜，所以在裁膜孵育抗体必须考虑清楚。
本文作者是"旺旺仙贝"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。
文稿：旺旺仙贝
校对：煲仔饭
素材：
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